Індукована поверхнею дисоціація нековалентних білкових комплексів у розширеному орбітрапі масового діапазону
Захарій Л. ВанАрнум
кафедра хімії та біохімії, Університет штату Огайо, Коламбус, штат Огайо, 43210, США.
Джошуа Д. Гілберт
кафедра хімії та біохімії, Університет штату Огайо, Коламбус, штат Огайо, 43210, США.
Михайло Євгенович Бєлов
b Thermo Fisher Scientific, Бремен, Німеччина
Олександр Олександрович Макаров
b Thermo Fisher Scientific, Бремен, Німеччина
Стеван Р. Хорнінг
b Thermo Fisher Scientific, Бремен, Німеччина
Вікі Х. Висоцький
кафедра хімії та біохімії, Університет штату Огайо, Коламбус, штат Огайо, 43210, США.
J.D.G: Thermo Fisher Scientific Inc., 5350 NE Dawson Creek Dr., Hillsboro, Oregon 97124.
Пов’язані дані
Анотація
Графічний реферат
Вступ
Поверхнево-індукована дисоціація (SID) виникла як потужний метод активації на основі зіткнення для зондування білкових складних структур у газовій фазі, що дає фрагментацію, що забезпечує інформацію, що доповнює інформацію, отриману від методів активації, згаданих раніше. 27 Замість того, щоб піддавати іони численним зіткненням низьких енергій з фоновим газом, експерименти SID направляють іони на інертну, тверду поверхню, щоб надати енергію аналіту за один високоенергетичний крок. SID, як правило, призводить до більш симетричного розподілу заряду у створених підкомплексах щодо CID 28 та UVPD. 26 Як спостерігається за допомогою приладів іонної рухливості (IM) -MS, субкомплекси, що генеруються за допомогою SID, як правило, компактні після дисоціації, перерізи зіткнень відображають біомолекулярні (суб) структури. 29 Крім того, SID зв’язаних з лігандами білкових комплексів часто призводить до субкомплексів з лігандами, що утримуються в кишені зв'язування, що часто не буває для CID. 30,31 Ці особливості роблять SID корисним інструментом для дослідження біомолекулярних комплексів без розв'язаних структур. 32–34
Донедавна робота із залученням SID білкових комплексів в основному проводилася на платформах TOF. 35,36 Зі зростанням використання нативних РС для структурної характеристики білкових комплексів стало очевидним, що часто бажано більшу роздільну здатність за масою і дозволяє глибше зрозуміти дану біологічну систему. Наприклад, вимірювання зсувів маси в результаті посттрансляційних модифікацій та/або зв'язування малих лігандів або кофакторів стає можливим на рівні білкового комплексу при достатній роздільній здатності. 37,38 Кожен тип аналізатора маси (TOF, FT-ICR, Orbitrap) має переваги та недоліки, і вибір інструменту часто залежатиме від вирішуваного питання. Нещодавно наша група продемонструвала SID на платформі FT-ICR, досягнувши неперевершеного масового дозволу підкомплексів, що генеруються SID. 39 Однак ми вважаємо, що такі методи активації, як SID, повинні бути нейтральними до постачальника та платформи, і що SID на платформах Orbitrap, оптимізованих для збільшення діапазону m/z, також буде корисним для користувачів мас-спектрометрії.
Експериментальна секція
Дизайн пристрою SID
(а) Технічне креслення пристрою SID з кріпильними кронштейнами. (b) Спрощене зображення поперечного перерізу пристрою SID, що показує траєкторію руху іонів справа наліво в режимі SID. (c) Схема модифікованої платформи EMR з прототипом SID-пристрою, встановленого між квадруполем і C-пасткою.
Виготовлення пристрою проводилося власноруч машинним цехом кафедри хімії та біохімії ОСУ, використовуючи алюміній для всіх електродів та полімерний ефір-ефір-кетон (PEEK) для монтажу та належного розміщення електродів. Початковий шлях іонів залишається безперешкодним, щоб забезпечити мінімальний вплив лише на експерименти MS (тобто без активації), а також експерименти CID (HCD). Коли потрібен SID, фронтальні електроди SID-пристрою налаштовуються на те, щоб спрямовувати іони на поверхню у верхній частині пристрою. Детальний опис поверхні, яка використовується для зіткнень, можна знайти деінде. 35 Коротко кажучи, поверхня скла була покрита шаром титану 10 Å, шаром золота 1000 Å, а згодом модифікована моношаром, що самостійно зібраний із фторуглероду. Детальні креслення та напруги, що подаються на пристрій SID, можна знайти на рисунку S1.
Мас-спектрометрія
Матеріали
Результати і обговорення
Стрептавідин
Стрептавідин служить модельною системою для експериментів з СІД. Це симетричний гомотетрамер D2 на 53 кДа, що складається з субодиниць, розташованих як димер димерів (рис. 2а). Після активації CID тетрамер стрептавідину дисоціює на сильно заряджені мономери та відносно низько заряджені тримери (рис. S3). 44 Така поведінка, коли одна субодиниця розгортається і бере із собою непропорційно велику кількість заряду, характерна для ІД через його багатоступеневий процес енергетичного осадження. 16–18 Важливо, що цей результат дисоціації від CID не підтримує відомий димер розташування субодиниць димерів. На відміну від цього, попередня робота показала, що СІД тетрамеру стрептавідину призводить до утворення димерів при низькій енергії та мономерів при високій енергії, що відповідає площам розділу та складній геометрії, що визначається кристалічною структурою. 30