Індукована жирними кислотами диференційна регуляція генів, що кодують активований проліфератором пероксисоми
Анотація
Цілі/гіпотеза
Транскрипційний коактиватор проліфератора пероксисоми, активований рецептором γ-коактиватор-1α (PGC-1α), посилює метаболічно відповідні шляхи, такі як глюконеогенез, окислення жирних кислот, термогенез, окисне фосфорилювання та біогенез мітохондрій. Оскільки регуляція експресії гена, що кодує PGC-1α (PPARGC1A) за поживними речовинами/метаболітами не було детально оцінено, метою цього дослідження було визначити, чи PPARGC1A (і PPARGC1B) експресія модулюється загальними жирними кислотами плазми в клітинах скелетних м'язів людини.
Методи
Міотрубки людини, які диференціювали in vitro, обробляли 0,5 ммоль/л міристату (C14: 0), пальмітату (C16: 0), стеарату (C18: 0), пальмітолеату (C16: 1ω7), олеату (C18: 1ω9) або лінолеат (C18: 2ω6). PPARGC1A/ МРНК визначали кількісно за допомогою RT-PCR. Активність мітохондрій визначалася утворенням формазану.
Результати
Неліковані клітини експресуються в 28 разів більше PPARGC1B мРНК ніж PPARGC1A мРНК (13,33 ± 2,86 проти 0,47 ± 0,08 фг/мкг загальної РНК, = 5). PPARGC1A експресія збільшилася в два-три рази за рахунок усіх випробуваних ненасичених жирних кислот (UFA) (стор
Вступ
PGC-1β, структурний гомолог, найближчий до PGC-1α, кодується окремим геном і демонструє подібний розподіл у тканинах. Роль, яку відіграє PGC-1β, недостатньо зрозуміла, але суттєве функціональне перекриття з PGC-1α передбачається тим фактом, що обидва білки, принаймні частково, здатні коактивувати однакові фактори транскрипції та викликати експресію подібний набір генів-мішеней. Однак нові знахідки у близнюків також вказують на функціональні відмінності, причому PGC-1β є більш важливим у мітохондріальному β-окисленні [4].
Даних про регуляцію цих двох транскрипційних коактиваторів поживними речовинами та метаболітами недостатньо. Таким чином, метою цього дослідження було визначити, чи модулюють експресію загальних плазмових НЕФА, які отримують з раціону, або ліполітично вивільняються із запасів тригліцеридів. PPARGC1A і PPARGC1B в клітинах скелетних м’язів людини in vitro.
Предмети, матеріали та методи
Культура клітин
Первинні клітини скелетних м’язів людини отримували за допомогою голчастих біопсій м’яза просторового бічного м’яза та вирощували та диференціювали, як описано раніше [5]. На 5-й день диференціації клітини обробляли або BSA без жирних кислот (Sigma-Aldrich, Тауфкірхен, Німеччина), як контроль, або 0,5 ммоль/л NEFA (Sigma-Aldrich), зв’язаного з BSA. Вихідні розчини (8 ммоль/л) міристату (C14: 0), пальмітату (C16: 0), пальмітолеату (C16: 1ω7), олеату (C18: 1ω9) та лінолеату (C18: 2ω6) та 4-ммоль/1 основний розчин стеарату (C18: 0) готували в буфері Кребса – Рінгера – HEPES, що містить 20% BSA, шляхом нічного перемішування при 37 ° C під азотом. Донори м’язових клітин були набрані в рамках дослідження сімей Тюбінгена для діабету 2 типу та дали письмову письмову згоду на це дослідження. Дослідження було схвалено місцевим етичним комітетом.
RT-PCR у реальному часі
Клітини обробляли протягом 20 год, а потім промивали та збирали методом трипсинізації. РНК виділяли за допомогою колонок RNeasy (Qiagen, Hilden, Німеччина). Загальна РНК, оброблена ДНКазою без РНКази I, була транскрибована в кДНК за допомогою зворотної транскриптази AMV та набору синтезу кДНК First Strand від Roche Diagnostics (Мангейм, Німеччина). Кількісну ПЛР проводили в трьох примірниках із SYBR Green на LightCycler (Roche Diagnostics), використовуючи такі праймери (Invitrogen, Карлсруе, Німеччина): PPARGC1A: вперед 5′-TGTGCAACTCTCTGGAACTG-3 ′, реверс 5′-TGAGGACTTGCTGAGTGGTG-3 ′; PPARGC1B: вперед 5′-GCTCTCCTCCTTCTTCCTCA-3 ′, реверс 5′-ATAGAGCGTCTCCACCATCC-3 ′; 28S рРНК: пряма 5′-ACGGCGGGAGTAACTATGACT-3 ′, зворотна 5′-CTTGGCTGTGGTTTCGCT-3 ′. Умови ПЛР були такими: PPARGC1A мРНК: температура відпалу 65 ° C, 45 циклів; PPARGC1B мРНК: температура відпалу 68 ° C, 45 циклів; Температура відпалу 28S рРНК 63 ° C, 50 циклів (MgCl2 у всіх реакціях 4 ммоль/л).
Визначення активності мітохондрій
Після обробки клітини, культивовані в двох примірниках, інкубували протягом 4 год з 0,5 мг/мл 3- (4,5-диметилтіазол-2-іл) -2,5-дифеніл тетразолію броміду (МТТ) перед лізисом протягом ночі додаванням двох об'ємів 10% SDS у 0,01 моль/л HCl. Був використаний набір для проліферації клітин I (MTT) від Roche Diagnostics. Лізати переносили в пробірки, струшували, а потім фотозамірювали барвник формазану, вироблений мітохондріальними дегідрогеназами, при 565 нм.
Результати
Неліковані in vitro диференційовані міотрубки людини виражали низький, але постійно виявляється рівень PPARGC1A мРНК (0,47 ± 0,08 фг/мкг загальної РНК, = 5). Рівні PPARGC1B мРНК були в 28 разів вищими в тих самих клітинах (загальна РНК 13,33 ± 2,86 фг/мкг, = 5).