Інгібітор Mdm2 Nutlin-3a індукує р53-опосередкований апоптоз шляхом транскрипційно залежного та

  • Розділений екран
  • Поділитися піктограмою Поділіться
    • Facebook
    • Twitter
    • LinkedIn
    • Електронна пошта
  • Значок Інструменти Інструменти

    • Кенсуке Кодзіма, Марина Коноплева, Тереза ​​Маккуїн, Сьюзен О'Брайен, Вільям Планкетт, Майкл Андріфф; Інгібітор Mdm2 Nutlin-3a індукує опосередкований p53 апоптоз за допомогою транскрипційно-залежних та незалежних від транскрипції механізмів і може подолати опосередковану Atm резистентність до флударабіну при хронічному лімфолейкозі. Кров 2006; 108 (3): 993–1000. doi: https://doi.org/10.1182/blood-2005-12-5148

      р53-опосередкований

      Завантажити файл цитування:

      Анотація

      Вступ

      В-клітинний хронічний лімфолейкоз (ХЛЛ) становить 25% усіх лейкозів і є найпоширенішою формою лімфоїдної злоякісності в західних країнах. 1 Показано, що лікування пуриновим аналогом флударабіном, який на сьогодні є стандартною терапією ХЛЛ, збільшує загальну частоту ремісій, покращує виживання без прогресування та збільшує середню тривалість клінічної відповіді, але не виживаність у пацієнтів, які раніше не лікувались. з ХЛЛ, порівняно з лікуванням окремим хлорамбуцилом або комбінованою хіміотерапією. 2-4 Хоча введення комбінованих схем на основі флударабіну покращило загальний успіх лікування ХЛЛ, виявлення нових методів лікування ХЛЛ залишається пріоритетним.

      ХЛЛ характеризується накопиченням довгоживучих CD5 + B лімфоцитів, які виявляють стійкість до апоптозу. Трифосфат флударабіну включається в ДНК спокійних клітин ХЛЛ під час відновлення синтезу ДНК і викликає пошкодження ДНК. 7-9 Розриви ланцюга ДНК можуть призвести до активації p53 та p53-залежних генів-мішеней, 10,11, і припускають, що p53-опосередкована індукція апоптозу в основному сприяє вбиванню флударабіном клітин CLL in vivo. 11,12 Також повідомлялося, що флударабін може викликати апоптоз клітин ХЛЛ in vitro незалежно від p53, 13,14, хоча значення in vivo залишається невідомим. 11,12 Клінічно наявність мутацій p53 у клітинах ХЛЛ пов’язано зі зниженням виживання та стійкості до лікування флударабіном. 15-17

      У цьому дослідженні ми досліджували потенційне терапевтичне використання активації р53 антагоністами Mdm2 при ХЛЛ. Ми виявили, що (1) інгібування Mdm2 ефективно індукує опосередкований p53 апоптоз у клітинах CLL, незалежно від рівнів експресії Mdm2 або Atm, (2) залежний від транскрипції апоптоз не завжди може бути основним способом, за допомогою якого p53 індукує апоптоз, і що виключна активація незалежний від транскрипції шлях може повністю індукувати апоптоз; (3) нутлін-3а та флударабін синергічно індукують опосередкований р53 апоптоз у клітинах ХЛЛ, що може подолати резистентність до флударабіну при ХЛЛ.

      Матеріали і методи

      Реагенти

      Селективний маломолекулярний антагоніст MDM2, Nutlin-3a (люб’язно наданий доктором Любомиром Т. Васильовим, Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ), 27 та 9-β-d -арабінофуранозил-2-фтороаденином (F-ара- A, флударабін). У деяких експериментах клітини культивували з 3,5 мкМ циклогексиміду (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі) або 200 мкМ Z-VAD-FMK (Alexis, Сан-Дієго, Каліфорнія). Циклогексимід та Z-VAD-FMK додавали до клітин за 1 годину до введення препарату. Кінцева концентрація диметилсульфоксиду (ДМСО) у середовищі не перевищувала 0,1% (об./Об.). При цій концентрації сам ДМСО не викликав апоптозу до 72 годин у первинних клітинах ХЛЛ.

      Первинні зразки та культури клітин

      Гепаринізовані зразки периферичної крові отримували у раніше нелікованих хворих на ХЛЛ із понад 70% злоякісних клітин після інформованої згоди, відповідно до інституційних рекомендацій та Гельсінкської декларації. Одноядерні клітини очищали центрифугуванням з градієнтом щільності Ficoll-Hypaque (Sigma Chemical, Сент-Луїс, Міссурі), а неадгезивні клітини ресуспендували в середовищі RPMI 1640, доповненому 10% FCS при щільності 5 × 10 5 клітин/мл. Клітини обробляли Nutlin-3a або F-ara-A, як при 1, 2,5, 5 або 10 мкМ, і інкубували протягом 72 годин при 37 ° C і 5% CO2 у зволоженій атмосфері. У комбінованих експериментах Нутлін-3а та F-ара-А 2 агенти одночасно додавали до клітин із співвідношенням фіксованої концентрації (1: 1) і клітини інкубували протягом 72 годин.

      Аналіз апоптозу

      Оцінку апоптозу аналізом зв’язування анексину V – пропідій йодид (ПІ) проводили, як описано. 28 Ступінь апоптозу визначали кількісно як відсоток V-позитивних клітин анексину, а ступінь лікарсько-специфічного апоптозу оцінювали за такою формулою: відсоток специфічного апоптозу = (тест - контроль) × 100/(100 - контроль). У формулі чисельник - це фактична кількість вбивств, що сталися, а знаменник - потенційна кількість вбивств, яка могла статися. Для вимірювання мітохондріального мембранного потенціалу (ΨΨm) клітини завантажували MitoTracker Red CMXRos (300 нМ) та MitoTracker Green (100 мкМ; обидва з Molecular Probes, Eugene, OR) протягом 1 години при 37 ° C. Потім ΔΨm оцінювали, вимірюючи утримання CMXRos (червона флуоресценція), одночасно коригуючи мітохондріальну масу (зелена флуоресценція).

      Вестерн-блот-аналіз

      Вестерн-блот-аналіз проводили, як описано раніше. 28 Були використані такі антитіла: кролячий поліклональний анти-p53 (FL-393; Санта-Крус Біотехнологія, Санта-Крус, Каліфорнія); мишачий моноклональний антифосфо-p53 (Ser 15, 16G8; Технологія сигналізації клітин, Беверлі, Массачусетс); мишачий моноклональний анти-Mdm2 (D-12; Санта Круз Біотехнологія); кролик поліклональний анти-Пума (Ab-1; EMD Biosciences, Сан-Дієго, Каліфорнія); кролик поліклональний анти-Бакс (BD Biosciences, Сан-Хосе, Каліфорнія); кролик поліклональний анти-Атм (Ab-3; Oncogene Research, Кембридж, Массачусетс); та моноклональний анти-β-актин миші (AC-74; Sigma Chemical).

      Кількість внутрішньоклітинного білка методом проточної цитометрії

      Для внутрішньоклітинного виявлення p53 клітини фіксували 2% параформальдегідом, просочували 100% холодним метанолом і інкубували протягом 1 години при 4 ° C з кон’югованим флуоресцеїном ізотіоціанатом (FITC) кон’югованим антитілом проти p53 або його ізотипним контролем (кон’югований FITC) набір реагентів для антитіл р53; BD Biosciences). Залучення конформаційних змін Bax аналізували за допомогою антитіла, спрямованого проти NH2-кінцевої області Bax (YTH-6A7; Trevigen, Gaithersburg, MD). 31 Клітинна фіксація, пермеабілізація та фарбування первинними антитілами або ізотипний контроль проводились за допомогою набору Dako IntraStain (Dako Cytomation, Carpinteria, CA), відповідно до інструкцій виробника. Після промивання клітини інкубували з курячими протимишачими антитілами Alexa Fluor 488 (молекулярні зонди) протягом 30 хвилин при 4 ° C.

      Імунофлуоресценція та конфокальна мікроскопія

      Імунофлуоресценцію та конфокальне мікроскопічне дослідження проводили, як описано раніше, 28 з незначними змінами. Клітини двічі промивали PBS, фіксували 2% параформальдегідом і просочували крижаним 100% метанолом. Клітини блокували у 5% нормальній козячій сироватці протягом 30 хвилин, після чого проводили інкубацію протягом ночі при 4 ° C з кролячими поліклональними антитілами проти p53 FL-393 (1: 100 об./Об.; Санта Круз Біотехнологія) та мишачим моноклональним антицитохромом c оксидаза IV (10G8, 1 мкг/мл; Молекулярні зонди). Після промивання клітини інкубували з курячим антиграбітовим вторинним антитілом Alexa Fluor 488 та вторинним антитілом до курячого протимиша Alexa Fluor 594 (молекулярні зонди), розведеним у 5% нормальній козячій сироватці протягом 30 хвилин при 4 ° C. Ядра були забарвлені DAPI (4 ', 6-діамідино-2-феніліндол). Зображення отримували за допомогою об’єктива PlanApo 60 ×/1,40 на конфокальному мікроскопі Olympus FV500 із програмним забезпеченням Fluoview версії 4.3 (Olympus, Melville, NY).