Інозин зменшує запалення і покращує виживання на мишачій моделі коліту

Inotek Pharmaceuticals, Беверлі, штат Массачусетс 01915; і

Кафедра хірургії Університету медицини та стоматології - Медична школа Нью-Джерсі, Ньюарк, Нью-Джерсі 01703

Inotek Pharmaceuticals, Беверлі, штат Массачусетс 01915; і

Кафедра хірургії Університету медицини та стоматології - Медична школа Нью-Джерсі, Ньюарк, Нью-Джерсі 01703

Inotek Pharmaceuticals, Беверлі, штат Массачусетс 01915; і

Анотація

Інозин, природний пурин, що утворюється в результаті розпаду аденозину, нещодавно було доведено, що він надає потужну протизапальну дію як in vivo, так і in vitro. У цьому дослідженні інозин оцінювали як потенційну терапію коліту. Коліт індукували у мишей введенням декстрансульфату натрію (DSS). Пероральне лікування інозином розпочинали або до початку коліту, або як післялікування після встановлення коліту. Оцінку пошкодження товстої кишки та запалення визначали грубо (маса тіла, ректальна кровотеча), гістологічно та біохімічно (рівні MPO, MDA та цитокінів у товстій кишці). DSS-індукований коліт значно посилював запальну інфільтрацію клітин у товсту кишку. Індукований DSS коліт також підвищував рівень перекисного окислення ліпідів у товстій кишці, цитокінів та хемокінів. Інозин захищав товсту кишку від DSS-індукованої запальної інфільтрації клітин та перекисного окислення ліпідів. Інозин також частково знижував ці параметри в експериментальній моделі встановленого коліту. Таким чином, лікування інозином може бути потенційною терапією коліту.

Реагенти були отримані з наступних джерел: DSS (40 000 МВт) - від ICN Pharmaceuticals; інозин, MPO людини, 1,1,3,3-тетраметоксипропан, тіобарбітурова кислота, додецилсульфат натрію, тетраметилбензидин, гексадецилтриметиламмоній бромід та перекис водню були від Sigma (Сент-Луїс, Міссурі); Миші BALB/c походили з ферм Taconic (Germantown, NY); і специфічні набори ELISA для цитокінів були від R&D Systems (Міннеаполіс, Міннесота).

Індукція коліту та лікування.

Для цих досліджень використовували самців мишей BALB/c, вік 8 тижнів, вагою 20–23 г. Тварин розміщують у приміщеннях із контрольованою температурою та циклом світло-темрява протягом 48 год перед початком експериментальних протоколів. Усі експерименти на тваринах проводились відповідно до «Посібника з догляду та використання лабораторних тварин» [Публікація DHEW № (NIH) 85–23, переглянута 1985 р., Доповіді Управління науки та охорони здоров’я, DRR/NIH, Бетесда, MD 20205 ] та із схвалення Інституційного комітету з догляду та використання тварин Inotek.

Мишей протягом усього експерименту годували 5% DSS, молекулярна маса 30–40 кДа, розчинена у дистильованій воді ad libitum (31). Інозин вводили або перорально, або інтраперитонеально двічі на день. Контрольних мишей обробляли носієм, який був або водою для перорального протоколу експерименту з інозином, або сольовим розчином для протоку експерименту з внутрішньочеревинним інозином. Для відкладених експериментів з обробкою інозину мишам давали носій до дня початку обробки інозином. Інозин вводили в дозах від 25 до 200 мг · кг −1 · день -1, і він базувався на нещодавніх дослідженнях тестування інозину на моделях запалення гризунів (14, 18, 25). Прийом розчину DSS контролювався протягом експериментів і виявилося незмінним серед експериментальних груп (дані не наведені).

Оцінка тяжкості коліту та впливу наркотиків.

Параметрами, зафіксованими в експериментах, були маса тіла, довжина товстої кишки, летальність та кровотеча з прямої кишки, визначені очним оглядом. Мишей зважували дні 1 і 10з подальшою індукованою колітом зміною ваги, вираженою у відсотках від початкової ваги. Мишей вбивали вивихом шийки матки, а товсту кишку резекували між ілеоцекальним з’єднанням і проксимальною прямою кишкою, близько до її проходу під малим тазом. Товсту кишку розміщували на невсмоктуючій поверхні і вимірювали лінійкою. Біопсії товстої кишки брали для гістологічного та біохімічного аналізу. Одну біопсію фіксували у 15% формальдегіді, вкладали у парафін та розрізали (зрізи 4 мкм). Потім зрізи фарбували гематоксиліном та еозином та переглядали дослідником (сліпим) та оцінювали ступінь тяжкості запалення (0 = відсутність, 1 = легка, 2 = середня та 3 = важка) та ступінь (0 = відсутність, 1 = слизова, 2 = слизова і підслизова, і 3 = трансмуральна), а також пошкодження крипти (0 = відсутні, 1 = базальна 1/3, 2 = базальна 2/3, 3 = крипти, що втратили наявний епітелій, і 4 = крипти та поверхневий епітелій втрачено), тут представлені репрезентативні розділи.

Діяльність MPO.

Біопсії товстої кишки гомогенізували (50 мг/мл) у 0,5% гексадецилтриметиламонію броміду в 10 мМ MOPS і центрифугували при 15000 g протягом 40 хв. Потім суспензію тричі обробляли ультразвуком протягом 30 с. Аликвоту надосадової рідини (20 мкл) змішували з розчином 1,6 мМ тетраметилбензидину та 1 мМ перекису водню. Активність вимірювали спектрофотометрично як зміну поглинання при 650 нм при 37 ° С, використовуючи зчитувач мікропланшетів Spectramax (Molecular Devices, Саннівейл, Каліфорнія). Результати виражаються як міліодиниці активності MPO на міліграм білка, які визначали за допомогою аналізу Бредфорда.

Аналіз малондіальдегіду.

Освіта малондіальдегіду використовували для кількісного визначення перекисного окислення ліпідів у товстій кишці та вимірювали як речовину, що реагує на тіобарбітурову кислоту. Тканини гомогенізували (100 мг/мл) у 1,15% буфері KCl. Потім двісті мікролітрів гомогенатів додавали до реакційної суміші, що складається з 1,5 мл 0,8% тіобарбітурової кислоти, 200 мкл 8,1% додецилсульфату натрію, 1,5 мл 20% оцтової кислоти (рН 3,5) та 600 мкл дистильованої H2O. Потім суміш нагрівали при 90 ° С протягом 45 хв. Після охолодження до кімнатної температури зразки очищали центрифугуванням (10000 g, 10 хв) і їх поглинання вимірювали при 532 нм, використовуючи 1,1,3,3-тетраметоксипропан в якості зовнішнього стандарту. Рівень пероксидів ліпідів виражали у вигляді наномолей MDA на міліграм білка (аналіз Бредфорда).

Рівні цитокінів товстої кишки.

Третю біопсію товстої кишки видалили та заморозили у рідкому азоті, а потім зразок гомогенізували у 700 мкл буфера Tris · HCl, що містить інгібітори протеази. Зразки центрифугували протягом 30 хв і супернатант заморожували при -80 ° C до аналізу. Рівні цитокінів визначали за допомогою ІФА.

Статистичний аналіз.

Результати представлені як середні значення ± SE; статистичний аналіз проводився з використанням одностороннього ANOVA з подальшим множинним порівнянням Стьюдента-Ньюмена-Кельса після спеціального аналізу, точного тесту Фішера, Манна-Уітні U-тест, або аналіз виживання Каплана-Мейєра, за необхідності, з a значення –1 · день –1 інозину внутрішньочеревно, відповідно. Подібним чином ректальна кровотеча була значно зменшена з 60 до 10 та 0%. Ми також досліджували рівні MPO та MDA в товстій кишці; в обох випадках інозин значно знижував рівень порівняно з тваринами, які отримували лікування. Рівні MPO знижувались з 337 ± 60 до 101 ± 21 та 69 ± 16 мО/мг білка при обробці інозином 100 або 200 мг · кг −1 · день -1. Подібним чином, рівні MDA знижувались з 3,5 ± 0,5 до 1,9 ± 0,3 нмоль/мг білка з 200 мг · кг −1 · день –1 інозину. Рівень МДА в товстій кишці після 100 мг · кг −1 · день –1 іп інозину становив 2,5 ± 0,4 нмоль/мг білка, що статистично не відрізнялося статистично від товстої кишки, обробленої носієм.