Клонування меж та характеристика 25-гідроксилази холестерину (ch25h) із морської телеості

Морське рибальство, аквакультура та живі ресурси

Ця стаття є частиною Теми дослідження

Харчування риб, метаболізм та фізіологія Переглянути всі 14 статей

Редаговано

Кан-ле Лу

Рибальський коледж, Університет Джимей, Китай

Переглянуто

Мін Джин

Університет Нінбо, Китай

Діжі Се

Південно-Китайський сільськогосподарський університет, Китай

Приналежності редактора та рецензентів є останніми, наданими в їхніх дослідницьких профілях Loop, і вони не можуть відображати їх ситуацію на момент огляду.

Завантажити статтю
- Завантажте PDF
- ReadCube
- EPUB
- XML (NLM)
- Додаткові
  Матеріал
Експортне посилання
- EndNote
- Довідковий менеджер
- Простий текстовий файл
- BibTex

ПОДІЛИТИСЯ НА

СТАТТЯ Оригінального дослідження

1 Науково-дослідний інститут рибного господарства Жовтого моря, Китайська академія рибних наук, Циндао, Китай
2 Лабораторія з морського рибного господарства та процесів виробництва харчових продуктів, Циндао, Національна лабораторія морської науки та технологій, Циндао, Китай

Вступ

Мембранно-асоційований фермент холестерину 25-гідроксилаза (Ch25h) каталізує утворення 25-гідроксихолестерину (25HC, оксистерол) із холестерину і, таким чином, відіграє важливу роль у метаболізмі холестерину та ліпідів (Lund et al., 1998; Horton et al., 2002; Джозеф та ін., 2002). Повідомлялося, що 25HC є ко-репресором, який блокує обробку білка, що зв'язує регулюючий елемент стеролу (SREBP), і в кінцевому підсумку призводить до інгібування транскрипції генів (Lund et al., 1998). 25HC також діє як ліганд рецептора X печінки (LXR). Регуляція сигнального шляху LXR/SREBP за допомогою 25HC зменшує синтез холестерину та збільшує його витікання та елімінацію (Janowski et al., 1996; Accad and Farese, 1998; Radhakrishnan et al., 2007). Регуляція сигнального шляху LXR/SREBP за допомогою 25HC також впливає на ліпідний обмін іншими способами, залежно від ролі SREBP та LXR у метаболізмі ліпідів (Shimano, 2001; Oosterveer et al., 2010; DeBose-Boyd and Ye, 2018). Окрім добре відомої метаболічної ролі оксистеролів, деякі публікації також повідомляють про функцію 25HC в імунній регуляції та резистентності до вірусів (Yi et al., 2012; Shrivastava-Ranjan et al., 2016; Cagno et al., 2017; Doms et al., 2018; Shawli et al., 2019; Zhang et al., 2019).

Порівняно із ссавцями, функції Ch25h або 25HC у риб були недостатньо вивчені. Лише у даніо підтверджено незалежну від інтерферону противірусну роль 25HC (Pereiro et al., 2017). На китайській підошві нещодавнє наше дослідження з випробуванням на годування з подальшим транскриптомічним аналізом показало це ch25h на транскрипцію в головному мозку суттєво впливала дієтична арахідонова кислота (ARA), яка відіграє важливу роль у розмноженні риб (Izquierdo et al., 2001; Norberg et al., 2017), і цей ефект різнився у чоловічих і жіночих риб (Xu та ін., 2019). Наші попередні дослідження також показали, що дієтична АРА диференційовано регулює стероїдогенез статевих залоз на підошві китайською мовою залежно від статі риби (Xu et al., 2017a). Підошва китайського мови має типові характеристики статевого диморфізму. Різна реакція метаболізму холестерину на дієтичну АРА на підошві чоловічої та жіночої китайської мови представляється цікавою і варта подальшого дослідження. Як подальше дослідження, це дослідження мало на меті клонувати та охарактеризувати повнорозмірну мРНК підошви китайського мови ch25h, а також дослідити його транскрипцію у відповідь на харчовий ARA в різних тканинах як чоловічої, так і жіночої риби. Результати сприятимуть загальним знанням фізіології Ch25h у риб.

Матеріали і методи

Випробування на годування

У дослідженні годування використовувались три експериментальні дієти, що містять різні рівні ARA (табл. 1). У контрольній дієті (дієта С) трістеарин використовували як основне доповнене джерело ліпідів. Дієти з низьким (Дієта ARA-L) та високим (Дієта ARA-H) рівнем ARA готувались заміною тристеарину в дієті С маслом, збагаченим АРА. Вміст ARA у трьох експериментальних дієтах становив 0,34, 2,53 та 9,63% від загальної кількості жирних кислот (TFA) відповідно (табл. 2). Постійні рівні збагаченої n-3 LC-PUFA олії та соєвого лецитину були доповнені до всіх дієт, щоб задовольнити вимоги. Експериментальні дієти готувались за звичайними процедурами в нашій лабораторії (Xu et al., 2016).

Таблиця 1. Склад і склад експериментальних дієт (г кг –1 сухих речовин) а .

Таблиця 2. Склад жирних кислот експериментальних дієт (% загальної кількості жирних кислот).

Було проведено 10-тижневе випробування годування, щоб дослідити вплив дієтичного ARA на ch25h вираз генів на підошві китайською мовою. Під час годування використовували підошву з китайського язика, що вилупилася восени минулого року. Перед експериментом рибу годували комерційною дієтою. У кожному поліетиленовому резервуарі (200 л) вирощували п’ятнадцять чоловічих риб із середньою початковою масою тіла 20,3 г та вісім жіночих риб із середньою початковою масою тіла 72,0 г. На початку випробування на годівлю рибу годували контрольним раціоном протягом 7 днів для адаптації до експериментальних умов. Випробування на годівлю проводилося в проточній системі морської води в Huanghai Aquaculture Co., Ltd., (Хайян, Китай). Кожна дієта була випадковим чином призначена для трьох повторюваних резервуарів. Риб годували вручну до видимого насичення двічі на день (9:00 та 17:00). Резервуари очищали щодня, відсмоктуючи залишки корму та фекалій.

Наприкінці випробування на годівлю (пізня осінь), після знеболення евгенолом (1: 10000), перед відбором проб визначали стан розвитку рибних залоз. Більшість самців риб були зрілими. Зрілість чоловічої риби підтверджена виділенням молока при обробці. Однак, на жаль, візуальне спостереження та мікроскопічне дослідження морфології ооцитів показали, що більшість жіночих риб були незрілими, а яєчники взагалі не розвинулися. П’ять зрілих чоловічих риб та п’ять незрілих жіночих риб на резервуар були розкриті, а також зібрані цілі зразки мозку, гонад та печінки. Всі зразки тканин негайно заморожували рідким азотом і зберігали при -86 ° C перед аналізом. Усі протоколи відбору проб, а також практики вирощування риби були розглянуті та схвалені Комітетом з догляду за тваринами та використання Інституту рибного господарства Жовтого моря.

Вилучення РНК та синтез кДНК

Загальну РНК у печінці екстрагували за допомогою RNAiso Plus [TaKaRa Biotechnology (Dalian) Co., Ltd., Далянь, Китай], а потім електрофорезували на 1,5% агарозному гелі для перевірки якості та цілісності. Концентрацію визначали за допомогою мікрооб'ємного спектрометра Colibri (Titertek-Berthold, Німеччина). Потім РНК була зворотно транскрибована набором реактивів PrimeScript TM RT за допомогою гумової гумки gDNA (Perfect Real Time) (TaKaRa) відповідно до інструкції користувача.