Конгруентна еволюція фізичної форми та генетичної стійкості у вірусу везикулярного стоматиту

Ізабель С. Новелла

Кафедра медичної мікробіології та імунології, Медичний коледж, Університет Толедо, Науковий кампус, Толедо, штат Огайо, США

Джон Б. Преслойд

Камерон Бук

Клаус О. Вільке

Центр обчислювальної біології та біоінформатики, Секція інтегративної біології та Інститут клітинної та молекулярної біології Техаського університету в Остіні, Остін, штат Техас, США b

Пов’язані дані

Анотація

ВСТУП

Схильна до помилок реплікація РНК-вірусів призводить до розвитку популяцій квазівидів (1–4), хмар тісно пов’язаних мутантів у балансі відбору мутацій (5–7). У популяціях квазівидів підвищена генетична стійкість може забезпечити селективну перевагу (8–11), оскільки менша кількість нащадків втрачається в результаті шкідливих або летальних мутацій. Генетична стійкість тут визначається як фенотипова незмінність, незважаючи на мутаційний тиск (12). Що стосується ландшафтів фітнесу, вибір надійності надає перевагу тим групам населення, які сидять на широких піках фітнесу замість вузьких піків фітнесу. Дослідження на цифрових організмах показали перевагу цього типу широких піків і призвели до виразу "виживання найплідніших" (13). Багато досліджень, присвячених значущості генетичної стійкості до еволюції молекул РНК, є комп'ютерним аналізом та моделюванням еволюції (11, 14-17). Цей підхід призвів до виявлення вибору для стійкості в геномах вірусу гепатиту С (18) та мікроРНК (19).

Розуміння надійності має особливе значення для розробки противірусних препаратів та вакцин. Смертельний мутагенез (30) полягає у збільшенні частоти мутацій для утворення популяцій з такою кількістю мутацій, що генетична інформація втрачається, і вірус не може реплікуватися (3, 6, 31). Цей підхід мав би обмежену користь, якщо вірус може адаптуватися, збільшуючи свою стійкість (32), але комп'ютерне моделювання припускає, що генетична стійкість сама по собі навряд чи може запобігти зникненню летальним мутагенезом (33). У пікорнавірусів, здається, існує кореляція між стійкістю та чутливістю до летального мутагенезу (34). Основним недоліком живих аттенуйованих вакцин є можливість реверсії під час реплікації у вакцинованого. Простіше кажучи, реверсія є випадком адаптації до людини-господаря, і оскільки ця адаптація залежить від наявності корисних змін, неважко уявити, що більш надійний вакцинний штам також буде безпечнішим вакцинним штамом. Однак суперечливим є питання про те, чи збільшені межі стійкості чи сприяють еволюційності (35–37).

Теоретичні та молекулярні міркування забезпечують зв'язок між генетичною стійкістю та термостабільністю (38–40), а робота над фагом phi-6 показала, що клони з високою стійкістю розвинули більшу термостабільність, ніж клони з низькою стійкістю (41). Робота над мікроРНК суперечлива, і хоча результати експериментів, здавалося б, демонстрували некорельовану генетичну стійкість та термічну толерантність (19), існують розбіжності щодо інтерпретації даних (42).

У цьому звіті ми використовували немутанізовані штами VSV, щоб перевірити, чи збільшений чи розслаблений відбір призвів до змін у генетичній стійкості та чи існує взаємозв'язок між стійкістю та термостійкістю. Ми проаналізували колекцію штамів, яку ми створили при проходженні від бляшки до бляшки (43, 44) або при проходженні великої популяції (29). Проходи від бляшки до бляшки мінімізують відбір, тоді як проходи з великою кількістю населення - відбір. Наші результати показали, що, як і передбачалося, за відсутності відбору спостерігалася втрата стійкості, тоді як при наявності відбору стійкість покращилася. Ми також виявили, що стійкість не потребує співвідношення з термостабільністю в VSV; однак, за відсутності відбору, генетична архітектура VSV, здається, накладає помірно сильний взаємозв'язок між міцністю та термостабільністю. Нарешті, несподівано, термостабільність зростала під час проходів від нальоту до бляшки, навіть незважаючи на те, що міцність знижувалася.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Клітини та віруси.

Визначення фізичної форми.

Фітнес вимірювали у безпосередній конкуренції, як описано раніше (45, 49). Для штамів, отриманих від wt, ми використовували MARM U як еталон, а для штамів, отриманих від MARM U, ми використовували wt як еталон. Підводячи підсумок, двох конкурентів змішували, і суміші використовували для визначення їх відносних співвідношень за допомогою аналізів нальоту у присутності та відсутності I1 MAb, а також для проведення змагального пасажу з 2 × 10 5 PFU. Через 20 - 24 год титри вірусу досягали приблизно 10 10 ПФУ/мл, а потомство від змагання використовувалось для кількісного визначення співвідношень та проведення другого змагального проходу за тих самих умов. Після декількох пасажів зміни співвідношення журналу були представлені з часом, а антилогарифмом нахилу придатності було значення фітнесу.

Вимірювання міцності.

Ми використовували стійкість до мутагенезу як сурогат стійкості. Ми засіяли колби Т-25 клітинами BHK-21 і після зростання протягом ночі обробили отримані напівпроточні моношари 5 мл розчину 5-фторурацилу (FU), розчиненого в MEM плюс FBS при кінцевій концентрації 0 (контроль), 10, 35 або 100 мкг/мл. Через 6,5 год інкубації при 37 ° С, під час якої концентрація лікарського засобу всередині клітин врівноважується, моношари інфікували приблизно 10 5 PFU, а інфекції контролювали на предмет цитопатичного ефекту (CPE), який розвивався повільніше із збільшенням концентрації мутагену, отже, за відсутності мутагену це було завершено через 24 год. післяінфекції, у присутності 10 мкг/мл це зайняло 48 год., а в присутності 35 або 100 мкг/мл - 72 год. Всі штами відновлювались одночасно у присутності даної кількості препарату. Коли CPE був завершений, ми відновили урожайність вірусів та визначили титри шляхом повторного аналізу нальоту. Потім ми нормалізували титри, поділивши їх на контрольний титр.

Для кількісної оцінки стійкості ми регресували трансформовані в журнал, нормалізовані титри проти концентрацій FU, перетворених у квадратний корінь. Дані були майже лінійними після цього перетворення для всіх мутантів (див. Малюнки в додатковому матеріалі). Лінія регресії була придатною без перехоплення, оскільки перетворений в журнал нормалізований титр за визначенням повинен бути нульовим. Ми використовували нахил лінії як міру міцності. Усі значення нахилу від’ємні, а більш негативний нахил вказує на більшу чутливість до FU і, отже, на меншу стійкість.

Визначення частоти мутантів.

Для масових та похідних популяцій ми визначили частоту I1-стійких мутантів. Зразки із заморожених запасів розводили за необхідності та титрували в трьох повторних аналізах нальоту без I1 для розрахунку загальної концентрації вірусу. Паралельно ми використовували більш концентровані зразки (як правило, на 3-4 порядки більше концентровані) для проведення аналізів нальоту при наявності надлишкових концентрацій I1 в агарозному шарі. Важливо, що ми не обробляли вірус антитілами до посіву, оскільки це лікування призвело б до значного заниження частоти мутантів через фенотипове змішування та приховування (50, 51). Номери бляшок за цих умов представляли б кількість мутантів MARM на складі. Для обчислення частоти мутантів ми визначили середні значення MARM, поділені на середні маси.