MiR-182-5p покращує життєздатність, мітоз, міграцію та здатність до інвазії раку шлунка людини

Юлін Лі

1 кафедра патофізіології Медичного університету Біньчжоу, Яньтай 264003, Шаньдун, Китай

Шудун Чень

2 відділення шлунково-кишкової хірургії, відділення II, афілійована лікарня Яньтай Юхуандін університету Циндао, Яньтай 264000, Шаньдун, Китай

Чженфей Шань

3 відділення урології, афілійована лікарня Яньтай Юхуандін університету Циндао, Яньтай 264000, Шаньдун, Китай

Ліян Бі

4 Відділ трансформаційної отології та неврології, Медичний університет Біньчжоу, Яньтай 264003, Шаньдун, Китай

Шенцян Ю

3 відділення урології, афілійована лікарня Яньтай Юхуандін університету Циндао, Яньтай 264000, Шаньдун, Китай

Йонгвей Лі

3 відділення урології, афілійована лікарня Яньтай Юхуандін університету Циндао, Яньтай 264000, Шаньдун, Китай

Сен Сю

5 Кафедра біохімії та молекулярної біології, Медичний університет Біньчжоу, Яньтай 264003, Шаньдун, Китай

Анотація

Вступ

Рак шлунка (ГХ) є однією з найпоширеніших злоякісних пухлин травної системи, має, за оцінками, 951 600 нових випадків і щорічно спричиняє 723 100 смертей [1]. Незважаючи на те, що в розвинених країнах спостерігається стійке зниження рівня захворюваності та смертності від ГХ, у менш розвинених районах він все ще має загрозливий третій ранг як за рівнем захворюваності, так і смертності [1]. Причини ГХ є складними і можуть включати такі фактори, як незбалансоване харчування, куріння, алкоголь та інфекція хелікобактер пілорі [2]. Крім того, повідомляється, що патогенез ГХ також пов'язаний з генетичними факторами, такими як метилювання ДНК, епігенетична інактивація декількох генів, ампліфікація та делеція генів та аномальні соматичні мутації [2].

Відсутність специфічних клінічних симптомів створює перешкоди для ранньої діагностики ГХ [3]. Тому пацієнтам з ГХ завжди діагностують на запущених стадіях, що призводить до серйозних метастазів та поганого прогнозу. П'ятирічна виживаність становить менше 30% [4–6]. Протягом останніх кількох десятиліть хірургічне втручання було основним варіантом лікування ГХ із допоміжним лікуванням хіміопроменевої та хіміотерапії [7,8]. Генна медикаментозна терапія є потенційним підходом до лікування ГХ [9]. Однак через недостатнє розуміння молекулярних механізмів розвитку ГХ, в даний час не існує ефективної терапії ГХ [10].

Дані бази даних TargetScan дозволяють припустити, що існує зв'язок націлювання між miR-182-5p та RAB27A. Ми зробили припущення, що miR-182-5p регулює активність у клітинах GC шляхом націлювання на RAB27A та провели серію експериментів для перевірки цієї гіпотези. Ми досліджували роль miR-182-5p та оцінювали його регуляторний механізм у пухлинах шлунка та прогресіях.

Матеріали і методи

Тканини людини

Тридцять тканин GC людини та паракарциноми (відстань від карциноми шлунка становила 2 см) були отримані з приєднаної лікарні Яньтай Юхуандін університету Циндао з 20 березня 2015 року по 20 травня 2016 року. Зразки заморожували у рідкому азоті для подальше навчання. Трьох тканин паракарциноми було виявлено трьома лікарями в лікарні та підтверджено відсутність раку. Усі пацієнти дали свою поінформовану згоду, а етичне схвалення було отримано від Комітету з етики людини приєднаної лікарні Яньтай Юхуандін університету Циндао.

Культура клітин

Клітинні лінії раку шлунка людини (HGC) та нормальні шлункові клітинні лінії людини, що містять HGC-27, MKN-45, SGC-7901 та MGC-803, були придбані у банку клітин Китайської академії наук (Шанхай, Китай) та культивовані в Меморіальному інституті Розуелл Парку (RPMI, Нью-Йорк, США) -1640 з 10% плодовою бичачою сироваткою (FBS) у зволоженій атмосфері 37 ° C і 5% CO2.

Вилучення РНК та кількісна ПЛР у режимі реального часу

Загальну РНК тканин і клітин екстрагували за допомогою реагенту TRIzol відповідно до інструкцій виробника. Потім загальні РНК (5 мкг) та мікроРНК (5 мкг) були зворотно транскрибовані в комплементарні ДНК (кДНК). Суміш ПЛР SYBR Green була використана для кількісного аналізу в кількісному аналізі ПЛР у реальному часі (qRT-PCR). Праймери для miR-182-5p, RAB27A та інших генів були придбані у RiboBio Co., Гуанчжоу, Китай (Таблиця 1). Вектори PCMV-Sport6 (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США) використовувались для рекомбінації кДНК RAB27A, а для підтвердження успішної рекомбінації використовували техніку секвенування ДНК (за контрактом із Sangon Biotech, Шанхай, Китай). U6 (RNU6B) та GAPDH використовувались як стандарти внутрішньої нормалізації для мРНК miR-182-5p та RAB27A відповідно. Статистика аналізувалась методом 2 - Δ Δ C t.