Місцевий фітнес-ландшафт зеленого флуоресцентного білка Природа
Предмети
Анотація
Ми проаналізували місцевий ландшафт фітнесу avGFP, оцінивши рівні флуоресценції генотипів, отриманих шляхом випадкового мутагенезу послідовності avGFP (рис. 1). Ми використали сортування клітин, що активується флуоресценцією (додаткова фіг. 1), і послідовно розподілили всю область кодування GFP, щоб проаналізувати флуоресценцію багатьох тисяч генотипів, створених шляхом випадкового мутагенезу послідовності дикого типу (додаткова інформація 2 та розширені дані, рис. 1) . Ми застосували кілька стратегій, щоб мінімізувати помилку нашої оцінки флуоресценції (Додаткова інформація 3.4 та 4.4), яка була оцінена на основі тисяч незалежних вимірювань послідовності дикого типу (коефіцієнт помилково негативних помилок = 0,08%) та генотипів, що включають мутації, відомі усунути флуоресценцію (коефіцієнт помилково позитивних помилок = 0,24%). Наш остаточний набір даних включав 56 086 унікальних послідовностей нуклеотидів, що кодують 51 715 різних білкових послідовностей. Наша процедура вводила в середньому 3,7 мутації на послідовність генів, і більшість аналізованих генотипів містили кілька, до 15, помилкових мутацій. Тим не менше, оскільки загальна кількість можливих послідовностей зростає експоненціально із числом мутацій, частка послідовностей, відібраних для вибірки, була незначною для послідовностей, що містять більше двох мутацій (Розширена таблиця даних 1). Ми використовували ці дані для обстеження місцевого фітнес-ландшафту GFP, аналізуючи ефект одиночної, подвійної та множинної мутацій.
a, Дикий тип avGFP (в центрі) та більшість поодиноких мутантів (внутрішнє коло) флуоресцирують зеленим. Генотипи з множинними мутаціями можуть виявляти негативний епістаз, поєднання нейтральних мутацій, що створюють не флуоресцентні фенотипи (сірий), або позитивний епістаз, при якому мутація в нефлуоресцентному генотипі відновлює флуоресценцію. , Послідовність GFP розташована по колу, кожна колонка являє собою один амінокислотний сайт. У першому колі інтенсивність кольору квадратів вказує на яскравість одиничної мутації на відповідному ділянці щодо дикого типу, показаного в центрі. Сайти з позитивною та негативною епістатичною взаємодією між парами мутацій пов’язані відповідно зеленою та чорною лініями. У колах, віддалених від центру, що представляють генотипи з множинними мутаціями, фракція колонки, пофарбована зеленим (чорним), представляє частку генотипів, що відповідає високій (низькій) флуоресценції серед усіх досліджуваних генотипів з мутацією в цьому місці. Ножиці позначають місце обмеження.
10% мутантних станів, що надають не флуоресцентний фенотип, тим не менше були зафіксовані при тривалій еволюції (Розширені дані, рис. 3b), і значна частина генотипів, що містять лише мутації, що ведуть до амінокислотних станів з ортологів GFP, була не флуоресцентною (додатковий Рис. 3), що вказує на те, що епістаз впливає на фітнес-пейзаж avGFP 16 .
a, Розподіли самостійно виміряної флуоресценції для 2442 послідовностей дикого типу (сірий), 1114 одиночних мутантів (синій) та оцінювана частка нейтральних мутацій (білий). , c, Поодинокі мутації місенсу, що сильно зменшують флуоресценцію (фіолетові), як правило, виникають на ділянках із внутрішньо орієнтованими залишками (), показаний на вибраному β-ланцюзі структури GFP (c).
a, Гіпотетичне представлення негативного та позитивного епістазу як функції кількості одиничних мутацій від avGFP. WT, дикий тип. , Частка спостережуваних нефлуоресцентних генотипів (червоний) та очікувана частка нефлуоресцентних генотипів, розрахована як сума ефектів логарифмічної флуоресценції окремих мутацій (синій). c, Розподіли епістазів для негативних та позитивних епістазів різної сили з очікуваною швидкістю помилкових виявлень показані сірим кольором.