Нанобіосенсори на основі FRET для візуалізації внутрішньоклітинних мікродоменів Ca2 та H

Алсу І. Замалєєва

1 Ecole Normale Supérieure, Institut de Biologie de l'ENS (IBENS), Inserm U1024, CNRS UMR 8197, Париж F-75005, Франція; Електронні листи: [email protected] (A.I.Z.); [email protected] (C.L.)

Гійом Деспра

2 Департамент Чімі, Дослідницький університет École Normale Supérieure-PSL, CNRS UMR 7203 LBM, 24, rue Lhomond, і Університет Сорбони, UPMC Univ Paris 06 LBM, 4 місце Жус'є, Париж F-75005, Франція; Електронні листи: ed.leik-inu.co@sarpsedg (G.D.); [email protected] (M.C.); [email protected] (J.-M.M.)

Камілла Луккардіні

Майоль Колло

Мішель де Ваард

3 Inserm U836, Інститут нейронауки Гренобля, Дослідницька група 3, LabEx Ion Channel Science and Therapeutics, Університет Джозефа Фур'є, BP170, Гренобль Седекс 09 38042, Франція; Електронна пошта: [email protected]

Мартін Охайм

4 Фізіологічна лабораторія мозку, CNRS UMR 8118, Faculté des Sciences Fondamentales et Biomédicales, Fédération de Neurosciences FR3636, Паризький університет Декарта, PRES Sorbonne Paris Cité, Париж F-75006, Франція; Електронна пошта: [email protected]

Жан-Моріс Маллет

Енн Фельц

Пов’язані дані

Анотація

1. Вступ

Для кращого задоволення умов виявлення іонних мікродоменів ми пропонуємо тут використовувати флуоресцентну та багатофункціоналізовану наночастинку, що несе кілька молекул іонних сенсорів, а також пептиди, що проникають у клітини (CPP), щоб полегшити її цитоплазматичну доставку. Ми використовували комерційну квантову точку (QD), тобто неорганічну колоїдну флуоресцентну частинку, як центральну ліску для нашого біосенсора. Широкий спектр поглинання, чітко визначений симетричний спектр випромінювання та велика яскравість та висока стійкість до вибілювання у порівнянні з маломолекулярними органічними флуорофорами роблять КТ хорошими донорами енергії для флуоресцентного резонансного переносу енергії (FRET) та полегшують виявлення одиничних КТ всередині живих клітини. Кілька молекул органічних іонів-індикаторів, пов'язаних з поверхнею КТ, діють як акцептори флуоресцентної енергії. Ефективність FRET цієї збірки визначається перекриттям спектра випромінювання КТ зі спектром поглинання флуоресцентного іонного індикатора, а також їх кількістю, орієнтацією та близькістю до поверхні КТ.

Тут ми повідомляємо про синтез, характеристику та перевірку пари FRET на основі QD/Ca (H) Ruby та демонструємо, що зв’язаний Ca (H) Ruby титрується проти Ca 2+/протонів як вільний барвник у розчині. Нарешті, ми перевіряємо як in vitro, так і in situ, клітину на основі FRET, що проникає в нанобіосенсор Ca 2+, а також нанобіосенсор H +, поглинений ендоцитотичним шляхом.

1.1. Матеріал та методи

Хімія сполук CaRuby1 та HRubies буде представлена відповідно в [17] та [19]. Хімія CaRuby2 описана в Додатковій інформації та задокументована зі схемою S1 для синтетичної стратегії та малюнками S1 – S46 для характеристики проміжних сполук синтезу та кінцевих сполук.

Більшість протоколів, що використовуються тут (для хімії поверхні КТ, умови підтримання стабільної експресії клітинної лінії BHK, що експресує NR2A-NMDAR, та їх використання для мікроскопії TIRF) були раніше описані в Довідковій інформації Замалеева та ін., 2014 [8] до яка стосуватиметься синтезу покритих пептидом КТ, функціоналізації КТ та їх очищення, культури клітин клітинної лінії BHK, що експресує NR2-NMDAR, та візуалізації одиничних частинок за допомогою мікроскопії TIRF. Тут ми в основному описуємо протоколи, що стосуються вивчення наносенсорів рН на основі HRu-PiAC.

1.2. Барвники ПЕГІЛУВАННЯ

ПЕГилирование CaRubies з використанням бічного ланцюга для хімічної хімії було детально описано [8]. Та сама процедура ПЕГилирования дотримувалась і для HRu-PiAC.

1.3. Флуориметрія

Методи, використовувані для CaRubies2, були опубліковані раніше [18]. Коротко, динамічний діапазон CaRuby для зондування Ca 2+ оцінювали на основі піку PL CaRuby, виміряного в розчині, що містить (в мМ) 100 KCl, 30 MOPS, де [Ca 2+] регулювали за допомогою набору Invitrogen Ca Buffer (Life Technologies, посилання: C-3008MP). Для титрування HR-PiAC ми використовували універсальний буфер рН, див. Додаток 3, с. 830 у [20], який має майже постійну іонну силу в діапазоні рН від 2 до 12. Криві флуоресценції коригуються для чутливості до рН флуоресценції КТ (детальніше див. Малюнок S3). Спектри флуоресценції FRET (500–700 нм) були отримані при світлі збудження при 407 нм, а спектри прямого випромінювання (550–700 нм) - при збудженні при 545 нм. Всі значення для пар FRET були розраховані після спектрального лінійного змішування, підлаштовуючись під спектри QD та Ca/HRuby (інструмент кріплення кривої MatLab).