Онтогенез метаболізму глюкози у райдужної форелі (Oncorhynchus mykiss) у світлі нещодавно

АНОТАЦІЯ

ВСТУП

Метою цього дослідження було проаналізувати гени метаболізму глюкози, тобто гени, що належать до двох основних шляхів, пов'язаних з глюкозою: гліколізу та глюконеогенезу (рис. S1), щоб: (i) виявити та охарактеризувати еволюцію дубльованих генів гліколізу в райдужна форель (тобто фосфофруктокіназа печінки та піруваткіназа печінки); (ii) визначити схему експресії дубльованих генів, пов’язаних з метаболізмом глюкози, тобто гліколітичних генів (глюкокіназних паралогів, gcka та gckb; паралогів фосфофруктокінази печінки, pfkla та pfklb; піруваткінази печінки та еритроцитів, pklr) та глюконеогенних генів (цитозольний мітохондріальні фосфоенол-піруват-карбоксикінази pck1 та pck2, відповідно; фруктоза 1,6-бісфосфатаза 1 паралоги fbp1a, fbp1b1 та fbp1b2; паралоги глюкози 6-фосфатази g6pca, g6pcb1.a, g6pcb1.b, g6pbc, gb gb, gb, gb, gb, gb, gb, gb, gb. відповідна загальна активність ферментів на критичних стадіях розвитку онтогенезу печінки; та (iii) вивчити схему експресії цих генів під час харчового переходу від ендогенного до екзогенного харчування у форелі, яка харчується дієтою, що не містить вуглеводів або з високим вмістом вуглеводів.

онтогенез

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Заява про етику

Експеримент проводився у суворій відповідності з правовими рамками ЄС, що стосуються захисту тварин, що використовуються в наукових цілях (директива 2010/63/ЄС) та керівними принципами французького законодавства, що регулює етичне поводження з тваринами (указ № 2001-464, 29 травня 2001 р.). Він був затверджений Дирекцією Departementale des Services Veterinaires (Французька ветеринарна служба) для проведення експериментів на тваринах (INRA 2002–36, 14 квітня 2002). Експериментальна станція INRA сертифікована для експериментів на тваринах за дозволом №. A64.495.1 Французької ветеринарної служби, відповідного органу.

Рибні дієти

Два експериментальні корми для алевінів райдужної форелі, тобто no-CHO (дієта без вуглеводів) та високо-CHO (дієта з дуже високим вмістом вуглеводів), були приготовані на наших власних підприємствах (INRA, Donzacq, Landes, France) у вигляді екструдованих гранул. В якості джерел вуглеводів були включені глюкоза та желатинізований крохмаль; білок походить з рибної муки, а ліпідні речовини, що містяться в їжі, з риб’ячого жиру та рибного борошна (табл. 1). Дві дієти мали однакову кількість ліпідів. Велике збільшення вмісту вуглеводів у їжі (~ 60%) у дієті з високим вмістом СНО компенсувалося меншою часткою білка (~ 20%). Ніяких вуглеводів не додавали до дієти без вмісту СНО, яка містила приблизно 60% сирого білка.

Склад і приблизний склад двох експериментальних дієт (без СНО та високої СНО)

Риба та експериментальний дизайн

Аналіз дієт

Хімічний склад дієт аналізували за допомогою наступних процедур: суху речовину аналізували після сушіння при 105 ° С протягом 24 год, вміст ліпідів отримували екстракцією петролейного ефіру (Soxtherm), вміст білка (N × 6,25) отримували Методом Кельдаля після перетравлення кислоти валову енергію вимірювали в калориметрі адіабатичної бомби (IKA, Heitersheim Gribheimer, Німеччина), а вміст золи вимірювали спалюванням зразків у муфельній печі протягом 6 год при 600 ° C.

Аналіз складу тіла ооцитів, ембріонів та ендогенних живильних алевінів

Вміст глікогену та глюкози аналізували у 600 мг об’єднаної риби (ооцити, ембріони від 2-ї до 23-ї стадії та ендогенні харчові алевіни, 31-та стадія). Вміст глікогену визначали методом гідролізу, раніше описаним Good et al. (1933). Кожен зразок подрібнювали в 1 моль л -1 HCl (VWR, США). На цьому етапі зберігали аліквоту для вимірювання вмісту вільної глюкози. Через 10 хв центрифугування при 10000 g, вільну глюкозу вимірювали за допомогою флуориметричного глюкозного набору Amplite ™ (AAT Bioquest ®, Inc., США) відповідно до інструкцій виробника. Решту розмеленої тканини кип'ятили при 100 ° C протягом 2,5 год, а потім нейтралізували 5 моль л -1 КОН (VWR, США). Потім рН розчину регулювали до 7,4 і вимірювали загальну глюкозу (вільна глюкоза + глюкоза, отримана в результаті гідролізу глікогену), використовуючи той самий набір, що і раніше. Вміст глікогену оцінювали шляхом віднімання рівня вільної глюкози.

Загальний вміст ліпідів визначали в двох примірниках методом сульфофосфованілуну, описаним Барнсом та Блекстоком (1973), використовуючи стандарт риб'ячого жиру (Сопропече, Булонь-сюр-Мер, Франція) замість холестерину.

Загальний вміст білка також вимірювали в двох примірниках, використовуючи метод Кельдаля, як для аналізу дієти.

В аналізі silico

Ортологічні гени pfkl та pklr в геномі веселки форелі (Berthelot et al., 2014) були ідентифіковані в браузері геному Oncorhynchus mykiss (Genoscope: http://www.genoscope.cns.fr/trout/), вилученому з бази даних SIGENAE ( http://www.sigenae.org) за допомогою інструменту BLAST (усі номери приєднання наведені в таблиці 2). Послідовності з інших видів були зібрані з бази даних Геном Ensembl (випуск Ensembl 77, жовтень 2014 р .: http://www.ensembl.org). Інструмент аналізатора послідовностей із програмного забезпечення EMBL Pfam (http://pfam.xfam.org) був використаний для підтвердження ідентичності послідовностей. Програмне забезпечення Genomicus, v01.01 (http://www.genomicus.biologie.ens.fr/genomicus-trout-01.01/cgi-bin/search.pl) було використано для підтвердження ідентичності генів pfkl.