Перетравлена пшенична клейковина пригнічує зв’язок між лептином та його рецептором BMC Біохімія Повний текст
Анотація
Передумови
Резистентність до лептину вважається основним фактором ризику ожиріння. Існує гіпотеза, що дієтичний білок зернових злаків може викликати стійкість до лептину, запобігаючи зв’язуванню лептину зі своїм рецептором. Недеградований дієтичний білок пшениці виявлено в сироватці крові людини при середньому рівні 41 нг/мл. Тут ми повідомляємо результати випробувань, чи перешкоджає ферментативно засвоєна клейковина пшениці лептину зв’язуватися з рецептором лептину в пробірці.
Клейковина з пшениці перетравлювалася пепсином та трипсином у фізіологічних умовах. Активність пепсину та трипсину видаляли з клейковинного дайджесту спін-фільтром 10 кДа або термічною обробкою при 100 ° C протягом 30 хв. Зв'язування з рецептором лептину лептину, змішаного з переваркою глютену, у ряді концентрацій вимірювали за допомогою технології поверхневого плазмонного резонансу.
Результати
Зв'язування дайджесту клейковини з рецептором лептину не виявлено. Спін-фільтрований дайджест глютену пригнічує зв'язування лептину з рецептором лептину, із 50% інгібуванням при концентрації дайджест-глютену
10 нг/мл. Термічно оброблений дайджест клейковини не пригнічував зв’язування лептину.
Висновки
Перетравлена пшенична клейковина інгібує зв’язування лептину з рецептором лептину, з напівмаксимальним інгібуванням при 10 нг/мл. Інгібування є значним при клінічно значущих концентраціях і, отже, може служити новим шляхом для дослідження, щоб зрозуміти молекулярні основи стійкості до лептину, ожиріння та супутніх розладів.
Передумови
Лептин - це поліпептид 16 кДа, що виділяється білою жировою тканиною в кровообіг, як нещодавно переглянув Чжоу та ін. [1]. Рівні лептину в циркуляції пропорційні масі жиру в організмі і коливаються відповідно до змін харчових станів. Концентрація лептину служить ключовим сигналом ожиріння для мозку, де лептин зв'язується і активує рецептор лептину. Лептин важливий у регулюванні ситості, ваги та енергетичного гомеостазу. Більшість пацієнтів із ожирінням мають високий рівень циркулюючого лептину, що свідчить про набутий стан стійкості до лептину, що визначається зниженою здатністю лептину пригнічувати апетит та збільшення ваги [2]. Резистентність до лептину вважається основним фактором ризику патогенезу надмірної ваги та ожиріння [2], що, в свою чергу, тісно пов'язане з різними порушеннями обміну речовин, включаючи дисліпідемію, серцево-судинні захворювання, інсульт, інсулінорезистентність та діабет 2 типу. Для пояснення стійкості до лептину було запропоновано кілька механізмів, включаючи порушення транспорту лептину, сигналізацію лептину та нейронні схеми, спрямовані на лептин [2].
У цьому дослідженні ми перевірили останню пропозицію згаданої гіпотези, яка полягає в тому, що білки зерна злаків пригнічують зв’язування лептину. Вже повідомлялося, що білки зернових злаків зв’язуються з рецептором Ламмерсом та ін., який виявив, що зернові пептиди зернових, отримані в результаті ферментативного перетравлення гліадину пшениці з кишковими ферментами пепсином та трипсином, у фізіологічних умовах зв'язуються з рецептором хемокінів CXCR3, що експресується в епітелії кишок мишей та людини, що призводить до вивільнення зонуліну та збільшення проникності кишечника [11 ]. Камікубо та ін. повідомляли, що агглютинін зародків пшениці зв'язується з рецептором лептину в пробірці та інгібує зв'язування лептину з рецептором лептину [12]. Аглютинін зародків пшениці міститься в борошні звичайного пшеничного, але не в крові людини [13]. Ми вирішили дослідити зерновий білок зерна пшениці, який є основним джерелом рослинного білка в їжі людини. Основним білковим компонентом пшениці є клейковина, яка є згуртованою та еластичною масою, що залишається після видалення крохмалю з борошна зернових злаків промиванням водою. Більш конкретно, пшенична клейковина - це композиція з декількох видів білків, таких як гліадини (молекулярна маса
30 кДа) та глютеніни (молекулярна маса
30-90 кДа). Споживання глютену значно зросло за останні сто років і пришвидшилось протягом останніх кількох десятиліть [14,15]. Це збільшення значною мірою зумовлене розведенням багатих на глютен сортів зернових культур, а останнім часом - використанням додаткової клейковини у випічці та переробці харчових продуктів, щоб зробити тісто простішим у роботі, а хліб пухким [15]. Соарес та ін. встановили, що безглютенова дієта знижує лептин, ожиріння, запалення та резистентність до інсуліну у мишей, незважаючи на подібне споживання енергії [16]. Чірдо та ін. повідомляли про наявність нерозкладеного гліадину пшениці в сироватці крові людини (при середньому рівні 41 нг/мл) [17], як раніше повідомляв також про інші дієтичні білки Хусбі та ін. [18,19].
Тут ми використовували технологію поверхневого плазмонного резонансу (SPR) для моніторингу взаємодії між лептином і рецептором лептину та його інгібування ферментативно перетравленою клейковиною з пшениці.
Методи
Перетравлення клейковини
Щоб імітувати фізіологічні умови в кишечнику людини, глютен з пшениці перетравлювався згідно протоколу Де Рітіса та ін. [20] з невеликими змінами. 100 г клейковини з пшениці (Sigma-Aldrich: G5004) перетравлювали в 1 л 0,2 н. HCl (pH 1,8), що містить 2 г пепсину (Sigma-Aldrich: P6887), при 37 ° C протягом 2 годин. РН періодично перевіряли і за необхідності доводили до 1,8 за допомогою HC1 або NaOH. Потім рН доводять до 8,0 за допомогою 2 N NaOH. Перетравлена пепсином клейковина додатково перетравлюється додаванням 2 г трипсину (Sigma-Aldrich: T4799). Отриману перетравлену пепсином та трипсином клейковину енергійно перемішували при 37 ° С протягом 4 годин. РН періодично перевіряли і за необхідності доводили до рН 8,0 за допомогою HC1 або NaOH.
Видалення пепсину та трипсину
Пепсин (молекулярна маса
40 кДа) і трипсину (молекулярна маса
25 кДа) видаляли з дайджесту клейковини або спіновим фільтруванням через фільтр 10 кДа, або термообробкою при 100 ° С протягом 30 хв з наступним центрифугуванням при 13000 г протягом 10 хв. Концентрацію перетравленого глютену після фільтрування або центрифугування визначали з поглинання при 280 нм, припускаючи поглинання 1 при 1 мг/мл. Щоб перевірити, чи залишається якась активність пепсину або трипсину, 1,8 мкг/мл лептину (рекомбінантний людський лептин, R&D Systems) інкубували в клейковинному дайджесті (лише спін-фільтрованим або спін-фільтрованим та термічно обробленим) протягом 1 год або 24 год на 37 ° С Зразки розчиняли за допомогою SDS PAGE (Invitrogen) і промокали за допомогою iBlot® Gel Transfer Stacks, PVDF, міні-набору (Invitrogen) відповідно до інструкцій виробника. Після промивання помарки інкубували з кон'югованим антилептином HRP антитілом (HyTest Ltd, кат. №2LE1C) при 4 ° C протягом ночі. Антитіло використовували у розведенні 1: 1000 щодо концентрації запасу в продукті (HyTest Ltd, кат. №2LE1C). Імунореактивні смуги були виявлені за допомогою реагентів ECL (GE Healthcare Life Sciences).
Дослідження SPR
Дані фази дисоціації встановлювались за допомогою одного експоненціального спаду:
Потім значення, отримане для k off, використовувалось під час підгонки даних фази асоціації, щоб отримати оцінку k on з наступним рівнянням:
Дані інгібування аналізували, знаходячи значення плато в кінці кожної ін’єкції окремого лептину або дайджесту лептину та глютену.
Результати
Видалення пепсину та трипсину
Вестерн-блоттінг показав залишки лептину для всіх перетравлених глютену як через 1, так і через 24 години. Це показує, що спін-фільтрація та термічна обробка усували всю активність протеази в клейковинному травленні, оскільки лептин в іншому випадку погіршився б.
Дослідження SPR
SPR-аналіз зв’язування лептину з рецептором лептину та його інгібування дайджестом клейковини. А) Приклади сенсорних діаграм, записаних під час ін’єкції 30 нМ лептину окремо (чорний) або в присутності 0,0022 (синій), 0,0045 (зелений), 0,018 (помаранчевий) або 0,3 (червоний) мкг/мл дайджесту клейковини через сенсорний чіп з іммобілізованим рецептор лептину-Fc химера. Рожева пунктирна лінія відповідає чорній лінії за допомогою рівняння 2 (див. Методи). Б) Приклад сенсограми, записаної під час буферного потоку після повного введення 30 нМ лептину (чорний). Рожева пунктирна лінія відповідає даним, використовуючи рівняння 1 (див. Методи). Дві вертикальні лінії виникають під час тривалої дисоціації часу, коли машина перемикається між двома насосами. В) Ділянка відносної інтенсивності на кінцевому плато зв’язування лептину під час ін’єкції 30 нМ лептину проти концентрації перетравлення глютену. Смужки похибки представляють стандартне відхилення трьох вимірювань.