Підготовка обличчя до кровоносних судин миші
Kyung Ae Ko
1 Кафедра кардіології відділення внутрішньої медицини Техаського університету, Центр раку імені Андерсона
Кейгі Фудзівара
1 Кафедра кардіології відділення внутрішньої медицини Техаського університету, Центр раку імені Андерсона
Суніл Кришнан
2 Кафедра радіаційної онкології, Техаський університет, Центр раку імені М. Андерсона
Джун-ічі Абе
1 Кафедра кардіології відділення внутрішньої медицини Техаського університету, Центр раку імені Андерсона
Анотація
Зрізи вкладених у парафін тканин зазвичай використовуються для вивчення гістології тканин та гістопатології. Однак важко визначити, що таке тривимірна морфологія тканини за такими зрізами. Крім того, зрізи тканин, що досліджуються, можуть не містити області всередині тканини, необхідної для цілей поточного дослідження. Це останнє обмеження заважає гістопатологічним дослідженням судин, оскільки судинні ураження розвиваються фокалізовано. Для цього потрібен метод, який дозволяє нам оглянути широку ділянку стінки кровоносної судини, від її поверхні до глибших областей. Ця вимога виконує підготовку судин до судин. У цій статті ми продемонструємо, як виготовляти препарати для обличчя аорти та сонної артерії миші та імунофлуоресцентно фарбувати їх для конфокальної мікроскопії та інших типів візуалізації на основі флуоресценції.
Вступ
Препарати для цілого горіння (вимовляється як än ˈfäs) дозволяють нам оглянути широку ділянку поверхні кровоносних судин, таку як вся аорта, від кореня аорти аж до загальних клубових артерій. Використовуючи такий зразок, забарвлений специфічними антитілами та іншими специфічними зондами, можна точно визначити місце ураження, а також місце, де відбуваються різні молекулярні події в ендотеліальних клітинах у поєднанні з атерогенезом, такими як зміни експресії, локалізації та посттрансляційних модифікацій білків. На додаток до вивчення атерогенезу, форма ендотеліальних клітин, яка спостерігається в препаратах для обличчя, використовується як показник регіональної моделі середнього кровотоку, усередненої за часом. Такі дані важливі для вивчення механосигналізації ендотеліальних клітин in situ. Для цього рутинні гістологічні перерізи судин не є корисними. Таким чином, для судинної медицини та біології особливо важливо придбати техніку виготовлення препаратів для боротьби з кровоносними судинами, що дозволяє спостерігати як широку поверхню судини, так і глибші підводні ділянки судини.
У цій статті ми проілюструємо спосіб приготування препаратів для обличчя аорти миші та сонної артерії для імунофлуоресцентного фарбування. Підготовку до обличчя можна проводити навіть після експериментальних маніпуляцій з цими судинами. Наприклад, сонна артерія може бути частково перев’язана, а потім проведена підготовка до обличчя після такої операції. З цієї причини в цій статті ми також опишемо, як ми робимо часткове перев’язування сонної артерії. Порівняно із виготовленням подібних препаратів із більших тварин, таких як щури, кролики та людина, мишачі судини мають невеликі розміри та більш крихкі, що вимагає додаткової обережності при поводженні під час хірургічної ізоляції судин та підготовці їх до фарбування антитіл та мікроскопії. Оскільки найбільш часто використовуваною твариною моделлю для генетичної модифікації є миша, для багатьох дослідників стає критично важливо обробляти судини миші, не пошкоджуючи їх. У цьому рукописі ми опишемо, як обробляти кровоносні судини миші під час підготовки препаратів аорти та сонної артерії миші. З метою демонстрації ми будемо використовувати мишей дикого типу C57/b6.
Протокол
Протоколи часткової перев'язки сонної артерії миші та ізоляції аорти та сонної артерії миші для імунозабарвлення обличчя затверджені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин (IBT 2014-9231).
1. Часткове лігування сонної артерії ліворуч
Підготуйте хірургічний простір, поклавши на стіл нагрівальну прокладку розміром 12 дюймів x 14 дюймів і накрийте подушку та стільницю великою чистою хірургічною драпіровкою. Відрегулюйте плече підставки стріли так, щоб поле зору стереомікроскопа було в центральній області нагрівальної площадки.
Увімкніть грільну панель на столі і встановіть регулятор з 3 налаштуваннями на середній рівень нагрівання. При такому встановленні температури поверхня хірургічної дошки (див. 1.6.1) становитиме 38-40 ° C.
Помістіть чисту клітку на іншу грілку. Увімкніть грілку, як зазначено вище. Ця клітка буде використовуватися для відновлення після операції (див. 1.16), а також житла.
На хірургічний стіл покладіть автоклавну стерилізаційну сумку, що містить ножиці райдужки (1 пара), щипці для тканини (1 пара), щипці для суперхватки (2 пари), пружинні ножиці (1 пара), тупий втягувач (1 пара; ширина 2,5 мм), голкотримач з круглою ручкою (1), стерилізований шовковий шов 6-0, аплікатори з бавовняними наконечниками, міні-бавовняні аплікатори, хірургічні портьєри та марлеві губки розміром 2 х 2 дюйма. Також поставте на хірургічний стіл пляшку для віджиму, що містить 70% етанолу, та іншу, що містить хлоргексидинову хірургічну скрубону.
Зважте мишку. Вага тіла необхідна для визначення відповідної кількості знеболення, яке буде введено безпосередньо перед операцією.
Помістіть мишку в індукційну камеру.
Увімкніть кисневий бак і випарник анестетика, щоб знеболити мишу в індукційній камері. Підтримуйте рівень ізофлурану на рівні 2%. Миша займає 3-5 хв.
Поки мишку знеболюють, підкладіть під стереомікроскоп менший шматок стерильної хірургічної драпіровки (24 дюйма х 24 дюйма), щоб створити хірургічну поверхню. Потім покладіть на драпіровану поверхню акрилову хірургічну дошку (яка була очищена 70% спиртом). Отже, хірургічна дошка повинна знаходитися на грільній панелі, але розділена двома шарами хірургічних портьєр.
Коли миша перестане рухатися в індукційній камері, переведіть мишу в зону дохірургічної підготовки та вставте ніс у конус носа, підключений до випарника (2% ізофлуран). Видаліть волосся навколо шийки матки за допомогою електричного тримера або лосьйону для видалення волосся. Ми рекомендуємо лосьйон для видалення волосся, оскільки цей метод не дасть розпущених шматочків волосся, які важко повністю видалити з хірургічної зони.
Помістивши конус носа на місце, перемістіть мишу до хірургічної дошки.
Закріпіть скотчем праву та ліву передні лапи до хірургічної дошки. Закріпіть скотчем обидві задні лапи з правого боку миші. Це спричиняє невелике обертання тіла миші, так що ліва сторона області шиї миші стає краще розташованою для операції.
Продезінфікуйте область розрізу 70% спиртом, хірургічним скрабом хлоргексидину і знову 70% спиртом. Накрийте мишу стерилізованою хірургічною драпіровкою, за винятком області розрізу шийки матки.
Підтвердіть пальцем ніг, що миша повністю знеболена, і дайте знеболення (капрофен 3-5 мг/кг) за допомогою внутрішньочеревної або підшкірної ін’єкції.
Під розсікаючим мікроскопом зробіть вентральний розріз середньої лінії навколо шийки матки за допомогою скальпеля або ножиць райдужки. ПРИМІТКА: Ми використовуємо ножиці, оскільки робоча відстань стереомікроскопа обмежена, що ускладнює використання скальпеля.
Оголіть ліву загальну сонну артерію (LCCA), відсунувши в бік і змінивши положення слинних залоз, які покривають кровоносні судини з лівого боку тварини.
Визначте всі кровоносні судини в хірургічному полі (Фігура 1). LCCA роздвоюється у лівій внутрішній сонній артерії (ICA) та лівій зовнішній сонній артерії (ECA). Поверхнева тиреоїдна артерія (STA) виникає із ЕКА на медіальній стороні. Потилична артерія (ОА) зазвичай виникає з ЕКА, але у деяких мишей вона виникає з ВСА.