Підсилення регуляції експресії генів білка 3 у м’язів у мишей після дієти з високим вмістом жиру,
Анотація
ЦІЛЬ: Проаналізувати вплив добавок вітаміну А як на нормальну жирову (NF) дієту, так і на дієту з високим вмістом жиру (HF), а також на лікування гострої ретиноевої кислоти (RA) на експресію роз’єднуючого білка 3 (UCP3) у мишей.
ДИЗАЙН: Мишей C57BL/6J годували протягом 18 тижнів дієтою NF або HF (відповідно 10 і 45 енергетичних% як жиру), як із нормальним вмістом вітаміну А, так і з надлишком вітаміну А (дієта 8 мг та 320 мг ретинілпальмітату/кг) відповідно). Вага тіла та споживання енергії реєструвались періодично. Рівні мРНК UCP3 та білка UCP3 у скелетних м’язах (soleus/gastrocnemius), а також рівні мРНК UCP1, UCP2 та UCP3 в міжлопатковій коричневій жировій тканині (BAT), а також рівні мРНК UCP2, білків UCP2 та лептин мРНК у складах білої жирової тканини (WAT). Також оцінювали ефект гострого лікування RA (100 мг/кг/добу, 4 дні) на рівні мРНК UCP3 у скелетних м’язах та BAT мишей ЯМР.
РЕЗУЛЬТАТИ: Добавки вітаміну А до дієти NF призвели до підвищення рівня мРНК UCP3 та білка UCP3 у м’язах, мРНК UCP1 у НДТ та мРНК UCP2 у паховій ВАТ, але не вплинуло на масу тіла та ожиріння мишей В6. ВЧ дієта сприяла ожирінню та підвищенню рівня мРНК UCP3 та білка UCP3 в скелетних м’язах, а також іРНК для всіх трьох UCP в НДТ. Доповнення ВЧ-дієти вітаміном А мало впливало на остаточне ожиріння і не призвело до подальшого збільшення мРНК м’язових UCP3 та мРНК BAT UCP1 у порівнянні з рівнями, досягнутими при незміненій ВЧ-дієті. Рівні мРНК жирового лептину знижувались після прийому вітаміну А, незалежно від вмісту жиру в раціоні. Після гострого лікування РА у мишей ЯМР також було виявлено підвищення регуляції м’язів, але не BAT, рівні мРНК UCP3.
ВИСНОВОК: Результати дають докази стимулюючого ефекту ретиноїдів на експресію м’язового UCP3 в природних умовах, і диференціальна ретиноїдна регуляція гена UCP3 у м’язах та BAT.
Вступ
Роз'єднані гени білка 3 (UCP3) і 2 (UCP2) (розглянуті в посиланні 1) були клоновані в 1997 році як гени, що кодують білки з високою послідовністю гомології до UCP1, внутрішнього білка мембрани мітохондрій коричневих адипоцитів, який становить молекулярну основу адаптивних термогенез в коричневій жировій тканині (НДТ). Коли активний, UCP1 може розсіювати енергію як тепло, роз’єднуючи окисне фосфорилювання. 1,2 Різні звіти (див. Посилання 1) показали, що UCP2 та UCP3 знижують потенціал мітохондріальної мембрани при ектопічній експресії у дріжджах, а нещодавно аналіз мишей-нокаутів UCP3 дав докази роз’єднання активності UCP3 в скелетних м’язах в природних умовах, 3,4, хоча результати суперечливі. 5
У цій роботі ми вивчали вплив хронічних дієтичних добавок вітаміну А на експресію UCP і на розвиток ожиріння, спричиненого дієтою, у мишей, схильних до ожиріння. Ми зосередились на UCP3, оскільки його можлива регуляція ретиноїдами раніше не розглядалася в експериментах в природних умовах. Хронічні добавки вітаміну А мало впливали на розвиток ожиріння, спричиненого дієтою, у мишей, схильних до ожиріння, але наші результати показують, що експресія UCP3 у м’язах реагує на дієтичні фактори, зокрема на жир та навантаження вітаміну А в раціоні, диференціальна регуляція UCP3 ретиноїдами в м’язах та BAT.
Методи
Експеримент з добавкою вітаміну А.
Гострий експеримент з лікування РА
Використовували 12-тижневих мишей-самців ЯМР (CRIFFA, Барселона, Іспанія), яких годували регулярною лабораторною чау (Panlab, Барселона, Іспанія) та утримували при 22 ° C з циклом 12:12 год світло-темно. Тварин акліматизували до температури майже нейтралітету (28 ° C) протягом одного тижня, після чого їх випадковим чином розподілили на дві експериментальні групи: тварин, які отримували РА, які отримували щоденну підшкірну ін’єкцію 100 мг/кг загальної транс-РА (Sigma, Мадрид, Іспанія) протягом 4 днів безпосередньо перед тим, як їх було вбито, та контрольних тварин, яким вводили носій (оливкова олія). Було проведено два незалежних експерименти (чотири та п’ять тварин на групу відповідно).
Збір тканин
На початку світлового циклу тварин вбивали СО2 з подальшим вивихом шийки матки та обезголовленням. Кров відбирали з шиї і готували сироватку. Міжлопатковий НДТ (BAT), паховий WAT (iWAT), епідидимальний WAT (eWAT) та заочеревинний WAT (rWAT) були вирізані в цілісності, зважені, швидко заморожені в рідкому азоті та зберігані при -70 ° C; м'яз ніг (gastrocnemius/soleus) також відбирали проби та заморожували в рідкому азоті.
Екстракція РНК та аналіз північного блоттингу
Реагенти та зонди використовувались фірмою Boehringer Mannheim (Барселона, Іспанія). Загальну РНК тканини виділяли за допомогою реагенту Tripure TM, і 10–20 мкг фракціонували за допомогою електрофорезу в агарозному гелі, переносили на нейлонову мембрану шляхом капілярного промокання в 20 × SSC і фіксували ультрафіолетовим світлом, все згідно Roca та ін. 14
РНК, що представляють інтерес, аналізували за допомогою процедури хемілюмінісценції, використовуючи антисмислові олігонуклеотидні зонди, мічені кінцем дигоксигеніном. 31 Були використані такі зонди: для мРНК UCP1, 5 ′ - IndexTerm GTTGGTTTTATTCGTGGTCTCCCAGCATAG-3 ′; 14 для мРНК UCP2, 5 ′ - IndexTerm GGCAGAGTTCATGTATCTCGTCTTGACCAC-3 ′; 14 для мРНК UCP3, 5 ′ - IndexTerm GACTCCTTCTTCCCTGGCGATGGTTCTGTAGG-3 ′; для мРНК лептину, 5 ′ - IndexTerm GGTCTGAGGCAGGGAGCAGCTCTTGGAGAAGGC-3 ′; 32 та для 18S рРНК, 5 ′ - IndexTerm CGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCG-3 ′. 32
Фіксовані мембрани попередньо гібридизували при 42 ° C протягом 15 хв у DIG-Easy Hyb, а потім гібридизували з відповідним олігонуклеотидним зондом (34 нг/мл, крім зонда 18S рРНК, який використовували при 70 пг/мл) у DIG -Легкий Hyb при температурі 42 ° C протягом ночі і подається на 2 × 15 хв промивання в розчині 2 × SSC/0,1% (мас./Об.) SDS при кімнатній температурі, після чого 2 × 15 хв. Промивання в 0,1 × SSC/0,1% (w/v) SDS при 48 ° C. Після блокування мембрани інкубували з кон'югатом анти-дигоксиген-лужна фосфатаза, потім з хемілюмінесцентним субстратом CDP-Star TM і, нарешті, піддавали впливу Hyperfilm TM ECL (Amersham, Buckinghamshire, UK). Смуги у плівках аналізували за допомогою сканерної фотоденситометрії, кількісно визначали за допомогою програми BioImage (Millipore, Бедфорд, штат Массачусетс, США), і нормалізували за допомогою відповідних значень 18S рРНК. РНК, що представляють інтерес, аналізували послідовно на одній і тій же мембрані після видалення з кип'ятінням 0,1% (мас./Об.) SDS.
Вестерн-блот-аналіз
Зразки заморожених eWAT, iWAT та м'язів ніг гомогенізували у забуференному фосфатом сольовому розчині (137 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 6,5 мМ Na2HPO4 та 3,5 мМ KH2PO4) у гомогенізаторі тефлон/скло. Гомогенати центрифугували при 500 g протягом 10 хв при 4 ° C, а загальний вміст білка в супернатантах визначали методом Бредфорда. 33 Білок (50 мкг) фракціонували за допомогою електрофорезу в полі-акриламідному гелі на 10% поліакриламідних гелях згідно з Леммлі 34, а потім електроблотували до нітроцелюлозної мембрани. Фарбування Понсо S дало візуальні докази правильного навантаження та електрофоретичного перенесення білків на нітроцелюлозну мембрану. Блокування та розвиток імуноблотів проводили з використанням посиленої системи аналізу вестерн-блот-методів хемілюмінісценції (Amersham Pharmacia Biotech, Бакінгемшир, Великобританія). Первинні кролячі антитіла проти UCP2 та UCP3 були придбані в Alpha Diagnostics (Сан-Антоніо, Техас, США); специфічність цих антитіл була раніше підтверджена Sivitz та ін. 35 смуг у плівках аналізували за допомогою сканерної фотоденситометрії та кількісно визначали за допомогою програми BioImage (Millipore, Бедфорд, Массачусетс, США).