Підвищена секреція та експресія міостатину в скелетних м’язах у жінок з надзвичайною ожирінням

Анотація

ЦІЛЬ -Ожиріння пов’язане з ендокринними відхиленнями, які передбачають прогресування інсулінорезистентності до діабету 2 типу. Оскільки показано, що скелетні м’язи виділяють білки, які можуть бути використані як біомаркери, ми охарактеризували секретований білковий профіль м’язових клітин, отриманих від надзвичайно ожиріння (ІМТ 48,8 ± 14,8 кг/м 2; оцінка моделі гомеостазу [HOMA] 3,6 ± 1,0) відносна для худих здорових суб'єктів (ІМТ 25,7 ± 3,2 кг/м 2; HOMA 0,8 ± 0,2).

секреція

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ -Ми припустили, що скелетні м’язи будуть виділяти білки, які передбачають тяжкість ожиріння. Для перевірки цієї гіпотези ми використали експериментальну конструкцію «знизу вгору» із використанням стійкого маркування ізотопів амінокислотами в культурі (SILAC) та рідинної хроматографії/мас-спектрометрії/мас-спектрометрії (LC-MS/MS) для ідентифікації та кількісної оцінки секретованих білків з культивованих міотрубок, отриманих від надзвичайно ожиріння, порівняно зі здоровими жінками, які не страждають на глубоку порожнину.

Клінічні характеристики суб'єктів-донорів для культури м'язових клітин

Стабільне маркування ізотопів та збір секретованих білків.

LC-MS/MS ідентифікація та кількісна оцінка 13 C6-Lys та немічених секретованих білків з нежирних та надзвичайно ожирілих первинних міотрубок людини. В: Білки з 18-годинного кондиціонованого безсироваткового середовища з немічених (нежирних) та 13 C6-Lys (надзвичайно ожирілих) міотрубок поєднували у співвідношенні 1: 1 і розчиняли за допомогою 4-16% SDS-PAGE. В: Базовий піковий хроматограф, що показує загальну інтенсивність піків та час утримання всіх пептидів, екстрагованих із зрізу гелю, від 37 до 15 кДа. C: Пептид, елюйований через 31,8 хв у вигляді дублету при m/z 706,4 та 709,4, що відповідає немеченому і 13 пептиду C6-Lys від людського GAPDH. Пептидна послідовність, показана поверх спектру, була отримана за допомогою аналізу MS/MS. Мічені та немічені пептиди знаходяться на відстані 3 Da у співвідношенні 1: 1 і узгоджуються з одним залишком 13 C6-Lys у подвійно зарядженому пептиді. (Будь ласка, див. Http://dx.doi.org/10.2337/db08-0943, щоб отримати якісне цифрове представлення цієї цифри.)

LC-MS/MS, ідентифікація білка та кількісне визначення.

LC-MS/MS ідентифікація та кількісна оцінка секретованого білка міостатину. В: Верхній спектр показує пептидний дублет з m/z 571,8 і 574,8, що відповідає неміченим і 13 пептидам C6-Lys від міостатину людини. Мічені та немічені пептиди мають 3 Da один від одного у співвідношенні 3: 1 і узгоджуються з одним залишком 13 C6-Lys у подвійно зарядженому пептиді. Пептидна послідовність, показана поверх спектру, була отримана за допомогою MS/MS аналізу фрагментованого пептиду. B: Жирним шрифтом підкреслено відносні положення інших пептидів міостатину, визначених у первинній послідовності міостатину людини.

Вестерн-блот-аналіз умовних середовищ, скелетних м’язів та плазми.

Рівні білка міостатину в кондиціонованих середовищах, м’язових клітинах, цілому скелетному м’язі та плазмі були перевірені за допомогою західного імуноблоту. Для збору секретованих білків для кількісного визначення рівня міостатину клітини (9-денні міотрубки) п’ять разів промивали PBS та інкубували з безсироватковим Optimem (Invitrogen) протягом додаткових 24 годин, як було описано раніше (18,19). Середовище Optimem містить фактори росту, що сприяють виживанню клітин при тривалих інкубаціях, і спеціально розроблено для характеристики секретованих білків. Кондиціоноване середовище декантирували у пробірки об'ємом 50 мл (BD Biosciences Falcon), центрифугували при 300g, а потім при 1000g та фільтрували через нейлоновий фільтр 0,22 мкм (Millipore) перед остаточним віджимом 100000g для видалення залишків клітинного сміття. Потім кондиціоновані середовища миттєво заморожували у рідкому азоті та ліофілізували під вакуумом, а потім осаджували 10% трихлороцтовою кислотою з наступним промиванням −20 ° C ацетоном, як описано раніше (18). Всього було зібрано 50 мкг білка на зразок, розділено SDS-PAGE і перенесено в мембрану PVDF Immobilon-P (Millipore).