Посилення імунітету Т-клітин CD8 у легенях за допомогою CpG-олігодезоксинуклеотидів підвищує захисний

Анотація

Імуностимулюючі олігодезоксинуклеотиди CpG (ODN) 2 подібні до таких у бактеріальній ДНК і стимулюють імунну відповідь на користь типу Th1 та прозапальної продукції цитокінів (1, 2, 3, 4). CpG ODN можна розпізнати за TLR9 вродженої імунної системи, що запускає імуномодулюючий каскад адаптивного імунітету. Було продемонстровано, що CpG ODN може посилювати вроджену імунну відповідь (5) та резистентність до інфекційних захворювань і може служити ад'ювантом для поліпшення адаптивних імунних відповідей на патогени (6).

Хоча ефективність CpG ODN як ад'ювантів вакцин для ДНК, білків та пептидних вакцин добре відома (7, 8, 9, 10, 11), не було відомо, чи будуть вони служити ефективними ад'ювантами для живих вірусних векторних вакцин. Віруси несуть власні ліганди TLR, такі як ssRNA або dsRNA, яка зв’язується з TLR7/8 або TLR3 відповідно. Таким чином, невідомо, чи CpG ODN, як ліганд TLR9, сприятиме подальшому розвитку імунної індукції. У цьому дослідженні ми розглядали це питання у випадку модифікованої вакцинії Анкара (MVA) (12, 13, 14) як вакцини проти летальної вакцинації, моделі для віспи. Однак результати повинні застосовуватися до інших вірусних векторних вакцин, що експресують рекомбінантну вакцину Ags (15, 16, 17, 18).

Матеріали і методи

Олігодезоксинуклеотиди

ODN були синтезовані в Центрі оцінки біологічних препаратів та базовому дослідницькому центрі. Імунну стимуляцію отримували введенням двох CpG ODN (GCTAGACGTTAGCGT та TCAACGTTGA). Мотиви CpG перемикали на TpG або GpC в контрольному ODN (GCTAGATGTTAGGCT та TCAAGCTTGA). Ні ендотоксину (вимірюваного хромогенним аналізом лізату амебоцитів Limulus), ні білка (вимірюваного за допомогою набору для аналізу білків біцинхонінової кислоти; Pierce Chemicals) не було виявлено в жодному препараті ODN. Ми використовували 25–100 мкг CpG ODN або контрольного ODN на дозу на тварину.

Віруси

Штам вірусу вакцинії WR спочатку був отриманий з американської колекції типів культур. Вірус вакцинії Wyeth, штат ради охорони здоров'я штату Нью-Йорк, був отриманий від Wyeth Laboratories. Обидва були вирощені в клітинах HeLa і титровані в клітинах BSC-1. Штам вірусу вакцинії MVA, отриманий від A. Mayr (Мюнхенський університет, Мюнхен, Німеччина) (12, 13), розмножували та титрували в клітинах фібробластів курячих ембріонів. Цей вірус був подарунком доктора. Б. Мосс, П. Ерл та Л. Уайатт (Національний інститут алергії та інфекційних хвороб (NIAID), Бетесда, доктор медичних наук) (23).

Миші, імунізація та виклик

Самки мишей BALB/c були придбані в Науково-дослідному центрі Фредеріка. Вибиваюча миша Jh несе цілеспрямоване видалення локусу JH, таким чином, що миші гомозиготні за відсутністю всіх чотирьох сегментів гена JH, в результаті чого клітини не можуть продукувати повну, рекомбіновану версію варіабельної області ланцюга H і є тому дефіцит В-клітин. Цей штам був зроблений на фоні BALB/c (Taconic Farms). Для досліджень захисту мишей BALB/c або В-клітинних дефіцитних мишей імунізували різними дозами MVA i.m. або IN. Через місяць після імунізації мишей отримували 10 6 PFU WR, і щодня вимірювали індивідуальну масу тіла. Мишей із втратою ваги> 25% потрібно було евтаназувати, що, як правило, вимагало припинення експериментів приблизно на 8 день, коли контрольна група досягла цього рівня. Подібні експерименти щодо захисту від вакцинії застосовувались раніше (20, 24). Виснаження клітин CD8 + або CD4 + було здійснено i.p. лікування mAb щодня протягом 4 днів (клон 2,43, 0,5 мг/миша/день для CD8 та GK 1,5, 1 мг/миша/день для CD4) (40, 41). Виснаження було підтверджено за допомогою аналізу FACScan, що клітини периферичної крові виснажені> 98%.

Очищення клітин

Селезінки видаляли асептично, і одноклітинні суспензії готували обережним проходженням тканини через стерильні екрани. Еритроцити лізували буферним хлоридом амонію, забуференним Трісом, а решту клітин ретельно промивали в RPMI 1640 (BioWhittaker), що містить 2% FBS (Gemini Bio-Products) (42). Легкі вирізали, уникаючи паратрахеальних лімфатичних вузлів, і двічі промили в RPMI 1640. Внутрішньопаренхімальні легеневі мононуклеарні клітинні суспензії виділяли шляхом перетравлення колагеназою/ДНазою та градієнтним центрифугуванням Percoll, як описано раніше (43).

IFN-γ ELISPOT

Планшети ELISPOT (Millipore) попередньо покривали протягом ночі анти-IFN-γ Ab (Mabtech). Клітини-мішені (P815, мастоцитома DBA/2, що експресує молекули класу I, але не молекули H-d d класу II) інфікували протягом ночі вірусом vSC8 вакцинії (44), промивали два рази та опромінювали УФ протягом 15 хв. Ефекторні клітини селезінки змішували з інфікованими клітинами-мішенями і центрифугували разом у конічних пробірках протягом 3 хв при 200 × g. Клітини спільно культивували протягом 1 год при 37 ° С, а потім переносили на планшет ELISPOT в обсязі 150 мкл/лунку. Через 24 години кокультивації клітини, що утворюють пляму IFN-γ, були розроблені вторинним анти-IFN-γ Ab (Mabtech), набором Vectasin ABC (Vector Laboratories) та набором субстратів AEC (Vector Laboratories). Оскільки наші клітини-мішені (клітини P815) експресують лише молекули класу MHC, а не класу II, (H-2K d, D d та L d), ми очікуємо, що більшість клітин, що продукують IFN-γ, є CD8 + класу I Т-клітини, обмежені MHC.

Аналіз нейтралізації вірусу вакцинії на основі FACS

Аналіз нейтралізації вірусу вакцинії проводили на основі проточної цитометричної детекції GFP, як описано Earl et al. (45).

Статистичні методи

Статистичний аналіз проводили із використанням парного тесту Стьюдента, що порівнює втрату ваги та виживання у групах імунізованих та неімунізованих мишей після виклику вірусом вакцинії (WR) (46).

Результати

Захисна ефективність імунізації MVA була покращена за допомогою використання CpG ODN як ад'юванту слизової для ІМ імунізації у мишей BALB/c. Групи мишей BALB/c (5/група) імунізували IN 0, 10 3, 10 4, 10 5, 10 6 та 10 7 PFU без (A) або (B) CpG ODN (25 мкг/доза) . Через місяць мишей отримували ВІН з використанням 10 6 ПФУ вакцинії WR. Індивідуальна втрата ваги, що вимірюється щодня, представлена як засіб для кожної групи. Ці експерименти проводили двічі із порівнянними результатами.

A, Захисну ефективність імунізації MVA неможливо покращити, використовуючи контрольний ODN як ад'ювант слизової для ІМ імунізації у мишей BALB/c. Групи мишей BALB/c (5/група) імунізували IN MVA 10 5 з контрольним ODN або без нього (25 мкг/доза). Через три тижні мишей отримували ВІН із 10 6 ПФУ вакцинії WR. Індивідуальна втрата ваги, що вимірюється щодня, представлена як засіб для кожної групи. B, CpG ODN є більш ефективним при застосуванні до щеплення MVA або разом з MVA, але не після введення MVA. Групи мишей BALB/c імунізували MVA (105 PFU) та CpG ODN. У групі 1 CpG ODN вводили за 1 день до введення MVA; у групі 2 CpG ODN вводили ІН разом з MVA; у групі 3 CpG ODN вводили IN через 1 добу після імунізації MVA; у групі 4 мишей імунізували IN лише MVA (10 7); а в групі 5 мишей не імунізували. Через три тижні після імунізації тваринам заражали ВН 1 × 10 6 вірусом PFU WR. Індивідуальна вага миші, що вимірюється щодня, представлена як засіб для кожної групи. Ці експерименти проводили двічі із порівнянними результатами.