Потенціал перехідного рецептора епітеліального каналу Mg2 Меластатин 6 регулюється дієтичним Mg2
Анотація
Mg 2+ є другим за поширеністю внутрішньоклітинним катіоном і відіграє важливу роль як фактор у багатьох ферментативних реакціях (1). Гомеостаз Mg 2+ залежить від балансу між кишковим всмоктуванням, нирковою екскрецією та обміном з кісткою (2). Регулювання загального балансу Mg 2+ в організмі в основному знаходиться в нирках, що точно відповідає абсорбції Mg 2+ в кишечнику. Приблизно 80% від загальної кількості Mg 2+ у плазмі фільтрується в клубочках (3,4), більшість з яких згодом реабсорбується вздовж нефрону (5). Вісімдесят п’ять відсотків відфільтрованого Mg 2+ реабсорбується пасивно в проксимальних канальцях і товстій висхідній кінцівці Генле (TAL). Дистальний звивистий канальчик (DCT) реабсорбує 5-10% відфільтрованого Mg 2+, і швидкість реабсорбції в цьому сегменті визначає кінцеву концентрацію Mg 2+ у сечі. Транспорт Mg 2+ в ДКТ має трансклітинну природу і на нього впливають дієтичні обмеження Mg 2+ та ряд гормонів (6,7). Однак молекулярні деталі та регуляція цього шляху залишаються в основному невідомими (5,6,8,9).
Спадкові порушення з первинною гіпомагніємією значно полегшили ідентифікацію транспортерів іонів епітелію в нирках. Наприклад, з'ясування генетичної основи ізольованої домінантної гіпомагніємії та гіпомагніємії з вторинною гіпокальціємією призвело до ідентифікації γ-субодиниці Na +, K + -ATPase та епітеліального перехідного потенціалу рецептора мелатотину 6 Mg 2+ (TRPM6) відповідно (10–12). TRPM6, який є членом надродини TRP, локалізується вздовж апікальної мембрани DCT. Гетерологічна експресія в ембріональній нирці людини 293 клітин TRPM6, але не TRPM6 мутантів, виявлених у пацієнтів з гіпомагніємією із вторинною гіпокальціємією, індукує Mg 2+-проникний катіонний канал, який жорстко регулюється внутрішньоклітинною концентрацією Mg 2+ (13). TRPM6 демонструє найвищу гомологію з TRPM7, який був ідентифікований як проникний іонний канал Mg 2+, який в першу чергу необхідний для клітинного гомеостазу Mg 2+ (13–15).
За аналогією з активним (повторним) поглинанням Ca 2+ у дистальній частині нефрону та тонкої кишки через епітеліальні канали Ca 2+ (транзиторний потенціал рецептора ванілоїд 5 [TRPV5] та TRPV6) (16), процес трансцелюлярного Mg Транспорт 2+ передбачається наступними послідовними кроками. Рухаючись сприятливим трансмембранним потенціалом, Mg 2+ потрапляє в епітеліальну клітину через апікальний епітеліальний канал Mg 2+ TRPM6. Далі Mg 2+ дифундує через цитозоль, який активно екструдується через базолатеральну мембрану (13). Молекулярна ідентичність цих останніх транспортерів Mg 2+ невідома. Більшість фізіологічних досліджень віддають перевагу Na + -залежному механізму обміну (17). Вхід Mg 2+, схоже, є кроком, що обмежує швидкість, і місцем регулювання.
Метою нашого дослідження було визначити місця активного поглинання Mg 2+ у мишей, досліджуючи профіль експресії TRPM6. Крім того, ми встановили, чи регулюється TRPM6 вмістом у їжі Mg 2+ та кальціотропними гормонами 17β-естрадіолом (17β-E2), 1,25-дигідроксивітаміном D3 (1,25 (OH) 2D3) та паратиреоїдним гормоном (PTH) . Вплив дієтичного вмісту Mg 2+ вивчали шляхом аналізу регуляції TRPM6 на рівні мРНК та білка та екскреції Mg 2+ та рівнях сироватки у мишей C57BL6, які годувались дієтами з дефіцитом Mg 2+, нормальними та збагаченими.
Матеріали і методи
Дослідження на тваринах
Для оцінки експресії мРНК TRPM6, TRPM7 та TRPV6 у різних тканинах ми побудували панель кДНК. З цією метою було вбито чотирьох мишей C57BL6, які годували повноцінним раціоном, що містив 0,2% Mg 2+ (мас./Мас .; SSNIFF spezialdiäten GmbH, Соест, Німеччина); були зібрані нирки, селезінка, мозок, серце, скелетні м’язи, печінка, легені, шлунок, кістки, дванадцятипала кишка, тонка кишка, клубова кишка, сліпа кишка та товста кишка; і виділяли загальну РНК. Щоб вивчити вплив дієтичного вмісту Mg 2+ на експресію TRPM6 та TRPM7 у нирках та товстій кишці, ми годували мишей C57BL6 (вік 12 тижнів) протягом дієти з дефіцитом 10 da Mg 2+ (0,005% мас./Мас. Mg), Mg 2+ -нормальна дієта (0,19% мас./Мас. Mg) або збагачена Mg 2+ (0,48% мас./Мас. Mg; SSNIFF spezialdiäten GmbH). Протягом останніх 24 годин дієтичного лікування тварин утримували в клітинах з метаболізмом і збирали 24-годинну сечу. Після закінчення дієтичного лікування брали зразки крові і вбивали тварин. Тканини нирок і товстої кишки відбирали і негайно заморожували в рідкому азоті.
Вплив 17β-E2 на рівень експресії мРНК TRPM6 у нирках оцінювали підставленими, двосторонніми оваріектомізованими (OVX) та щурами OVX, які отримували 2 × 500 мкг 17β-E2/д, як описано раніше (18). Вплив ПТГ вивчали підроблені, паратиреоїдектомізовані (РТХ) та РТХ щури, які отримували 6 одиниць/день бичачого ПТГ, як описано раніше (19). Крім того, ефект 1,25 (OH) 2D3 вивчали мишами, що нокаутують 1α-гідроксилазу (1α-OHase -/-), гетерозиготними (1α-OHase +/−) мишами, які фенотипово ідентичні мишам дикого типу, та 1α-OHase -/- мишей, доповнених внутрішньочеревно 1,25 (OH) 2D3, як описано раніше (20). Колегія з питань етики тварин Університету Радбоу Неймеген затвердила всі експериментальні процедури.
Кількісний аналіз ПЛР у реальному часі
Загальну РНК екстрагували з нирок, повних сегментів кишечника та інших тканин за допомогою реагенту для ізоляції загальної РНК TriZol (Life Technologies BRL, Бреда, Нідерланди) відповідно до протоколу виробника. Отриману РНК піддавали обробці ДНКазою (Promega, Madison, WI) для запобігання забрудненню геномної ДНК. Після цього 2 мкг РНК транскрибували реверсною транскриптазою вірусу лейкозу Молоні-Миша (Invitrogen), як описано раніше (21). КДНК використовували для визначення рівнів експресії мРНК TRPM6, TRPM7 та TRPV6, а також рівні мРНК господарського гена гіпоксантин-гуанін-фосфорибозилтрансферази (HPRT) як ендогенного контролю. Рівні експресії мРНК визначали за допомогою ПЛР у режимі реального часу на системі виявлення послідовності ABI Prism 7700 (PE Biosystems, Роткройц, Швейцарія). Праймери та зонди, які націлені на гени, що цікавлять, були розроблені за допомогою комп'ютерної програми Primer Express (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія) і перелічені в таблиці 1.
Послідовності праймерів і зондів Такмана для кількісної ПЛР в режимі реального часу
Аналіз поглинання In Vivo 45 Ca 2+
Кишкове всмоктування Ca 2+ оцінювали у двох групах мишей C57BL6 шляхом вимірювання кількості 45 Ca 2+ у сироватці крові на ранніх етапах часу після перорального введення (15 мкл/г маси тіла). Миші голодували протягом 12 год перед тестом. Під час експерименту тварини були гемодинамічно стабільними під наркозом. Розчин, який використовували для вимірювання поглинання Ca 2+, містив 0,1 мМ CaCl2, 125 мМ NaCl, 17 мМ Tris (pH 7,4) та 1,8 г/л фруктози і збагачувався 20 мкСі 45 CaCl2/мл (18 Ci/г; New England Nuclear, Ньютон, Массачусетс). Одна група отримувала розчин 45 Ca 2+ з добавкою MgCl2 до кінцевої концентрації 10 мМ, тоді як розчин 45 Ca 2+ групи 2 не доповнювала MgCl2. Зразки крові отримували з різними інтервалами часу (2, 4, 8 та 12 хв). Радіоактивний 45 Ca 2+ аналізували в сироватці (10 мкл) методом рідинного сцинтиляційного підрахунку. Зміна концентрації Ca 2+ у сироватці розраховували за вмістом 45 Ca 2+ у зразках сироватки та питомою активністю введеного Ca 2+ .
Аналітичні процедури
Сироватку Mg 2+ та Ca 2+ вимірювали за допомогою набору для колориметричного аналізу згідно з протоколом виробника (Roche Diagnostics, Woerden, Нідерланди). Екскреція Mg 2+ та Ca 2+ із сечею визначалася за допомогою атомно-абсорбційної спектрофотометрії на Perkin Elmer AAnalyst 300 (Perkin Elmer, Milano, Italy).