Повнотекстовий mTORC2, що не містить клітин, бере участь у індукції фосфорилювання RSK сироваткою або
Фосфорилювання RSK у місці гідрофобного мотиву зменшується в клітинах, порушених mTORC2. (A) RSK має два збережені каталітичні домени, N-кінцевий (NTKD) та C-кінцевий (CTKD) кіназні домени, які фосфорилюються в кожному з їх циклів активації (T-Loop). Ці два домени фланкують лінкерну область, яка зберігається серед AGC-кіназ, що містять збережений поворот (TM) та гідрофобні мотиви (HM), які фосфорилюються у зазначених ділянках. (B) Дикий тип (WT) або SIN1 -/- MEF вирощували в повному DMEM (базальний; B) або вирощували, а потім голодували сироваткою протягом ночі. Сироватку повторно додавали і клітини інкубували протягом зазначеного часу (хв) перед збором урожаю. Загальні лізати готували з CHAPS, що містить буфер, і піддавали SDS-PAGE та імуноблотингу з використанням зазначених антитіл. (C) Клітини HeLa трансфікували за допомогою контролю скремблювання (scr) або siRNA, націленого на mTOR. Клітини лізували за допомогою RIPA і обробляли, як у В. (D) Тимоцити з диким типом (+/+), гетерозиготною (+/−) або гомозиготною (-/-) делецією риктора лізували і піддавали SDS-PAGE та імуноблотингу. (E) Тимоцити дикого типу (WT) або дефіциту риктору не стимулювали (0) або стимулювали антитілом CD3ε (10 мкг/мл) протягом зазначеного часу (хв).
Активація ERK є важливою, але недостатньою для повного фосфорилювання сайту RSK HM. (A) Клітини HeLa ресуспендували у повному середовищі без сироватки у присутності або відсутності 15 мкМ U2016 протягом зазначеного часу. 1 × FBS (сироватка) додавали, як зазначено, протягом останніх 0,5 год перед збором урожаю. Клітини збирали в буфері лізису CHAPS, а білкові екстракти піддавали SDS-PAGE та імуноблотингу з використанням зазначених антитіл. (B) Дикий тип (WT) або SIN1 -/- MEF вирощували в повному DMEM (базальний; B) або вирощували, а потім голодували сироваткою протягом ночі. Сироватку повторно додавали і клітини інкубували протягом зазначеного часу (хв). Клітини збирали та обробляли, як у (А). (C) WT або SIN1 -/- MEF вирощували протягом ночі за відсутності сироватки з подальшим додаванням сироватки або РМА протягом зазначеного часу. (D) WT або риктор -/- тимоцити не стимулювались (0) або стимулювали анти-CD3 та 10 нг/мл PMA протягом зазначеного часу (хв).
Фосфорилювання на сайті RSK HM підвищується під час виведення поживних речовин. (А - Г). Вирощування HeLa (A - C) або WEF MEF (D) ресуспендували в середовищах з або без 1-кратного діалізованого FBS (dFBS) (або 1 × dFBS, як зазначено в (C, D) і не маючи (-) або містять (+) або глюкоза (A), глутамін (B) або як глюкоза, так і глутамін (C, D) у зазначений час. У (C, D) клітини збирали через 1 год. Клітини лізували буфером RIPA та обробляли на SDS-PAGE (E) Зростаючі клітини ресуспендували в середовищах з dFBS у відсутність або присутність глюкози та/або 500 мкМ 2-дезоксиглюкози (2DG) та інкубували протягом зазначеного часу. (F) Вирощування WT або SIN1 -/- MEFs ресуспендували в середовищах без браку глюкози, глутаміну та/або dFBS або інкубували протягом 1 год перед збором. Клітини збирали та обробляли на SDS-PAGE та імуноблотинг.