Придушення вивільнення ентероендокринних клітин глюкагоноподібного пептиду (GLP) -1 шляхом індукованого жиром малого
Шлункове шунтування при ожирінні Roux-en-Y надає швидкі, не залежні від ваги ефекти на метаболізм глюкози, що не можна пояснити лише періопераційним голодуванням.
Які нові висновки?
Кетогенез кишечника, спричинений тривалим годуванням з високим вмістом жиру, може бути механізмом, що притупляє чутливість GLP-1 у пацієнтів із ожирінням перед операцією. Після шунтування шлунка цей механізм може бути полегшений за рахунок гальмування кишкового кетогенезу, сприяючи швидкому поліпшенню реакції GLP-1 після операції.
Як це може вплинути на клінічну практику в осяжному майбутньому?
Може бути можливо фармацевтично націлити кишковий кетогенез і тим самим протидіяти діабетогенному ефекту ожиріння без необхідності шлункового шунтування.
ВСТУП
Шлунковий шунтування Roux-en-Y (RYGB) ефективний при тривалому лікуванні патологічного ожиріння та діабету типу 2. Втрата ваги сама по собі є важливим фактором поліпшення метаболічного стану, але RYGB також активує ранню післяопераційну, незалежну від ваги механізми, наприклад, індуковане їжею викид пептидів кишечника.2 3 Такі ефекти, пов’язані з RYGB, підкреслюють ефекти анатомічної реконфігурації травного тракту в метаболізмі всього тіла. Тому ми використовували RYGB як модель, щоб спробувати знайти нові кишково-асоційовані механізми в проксимальній частині тонкої кишки для поліпшення метаболізму глюкози.
Матеріали і методи
Хірургія та пацієнти
Додатковий матеріал
Характеристика пацієнта в групах протеоміки, підтвердження та дієти
Аналіз глобальної експресії білка слизової оболонки товстої кишки
Ця методика була описана раніше. 11 Для подальшого аналізу були включені лише білки, які постійно змінювались у всіх пацієнтів і принаймні на 50% від вихідного рівня.
Дослідження на тваринах
Чоловіків мишей C57BL/6J від чотирьох тижнів до 5 тижнів було придбано у Harlan (Horst, Нідерланди). Тварин утримували при контрольованій температурі (23 ° C) та світлі (ввімкнене світло, 06: 30–18: 30 годин), з вільним доступом до води та гранульованої їжі (R34 Lactamin, Kimstad, Швеція) із вмістом поживних речовин у г %: жир 4%, білок 16,5%, вуглеводи 58,0%; загальна калорійність: 3 ккал/г. Починаючи з 6 до 8 тижнів, мишей годували HFD або нежирною дієтою (LFD) протягом 3 тижнів або 3 місяців. HFD складався з гранульованої їжі (Surwit Diabetogenic Dietogen Diet, D12309; Research Diets, New Brunswick, New Jersey, USA) і мав вміст поживних речовин у г%: жир 35,9%, білок 23%, вуглеводи 35,5%; загальна калорійність: 5,6 ккал/г. Тварини з НДН продовжували отримувати звичну дієту (R34).
У першому наборі експериментів мишей забивали через 3 тижні або LFD, або HFD, і різні частини тонкої кишки; дванадцятипала кишка (проксимальна 3 см), тонка кишка (середня 3 см) та клубова кишка (дистальна 3 см), а також печінка. Зразки повної товщини кишкової стінки та однієї частки печінки швидко заморожували у рідкому азоті та зберігали замороженими (-70 ° C) для подальшого аналізу експресії білка методом Вестерн-блот (див. Нижче).
У другому наборі експериментів мишей годували LFD або HFD протягом 3 місяців. У досліджуваний день їжу виймали протягом 45 хв перед експериментами, щоб синхронізувати стан годування. На початку експерименту було проведено пероральне введення з 250 мкл інтраліпіду (соєва олія 200 мг/мл, очищені фосфоліпіди яєць, гліцерин, гідроксид натрію, вода; Fresenius Kabi, Швеція), що містить будь-який носій (20 мкл етилацетату ), 2,5 мг інгібітора мітохондріального 3-гідрокси-3-метилглутарил-КоА-синтази (mHMGCS) гімеглюзину (Санта Круз Біотехнологія, Санта Круз, Каліфорнія, США; розчинений у транспортному засобі) або 25 мг β-гідроксибутирату (βHB, Sigma- Олдріч, Сент-Луїс, Міссурі; розчинено в транспортному засобі). Через 15, 30 або 120 хв з хвоста відбирали зразки венозної крові та аналізували βHB за допомогою β-кетонового датчика GlucoMen LX (A. Menarini Diagnostics, Firenze, IT).
У третьому наборі експериментів мишей тримали на НЧ або НЧ протягом 3 тижнів і голодували протягом 6 годин до початку експерименту. Потім було проведено оральний зонд 500 мкл інтраліпіду (Fresenius Kabi), і через додаткові 90 хв мишей знеболювали за допомогою ізофлурану. Виконали лапаротомію, ідентифікували та пробили ворітну вену за допомогою тонкої голки та взяли кров. Зразки периферичної крові одночасно брали з ока. Зразки крові центрифугували для приготування сироватки. βHB аналізували в сироватці крові за допомогою набору для аналізу тіла на кетоні EnzyChrom (BioAssay Systems, Hayward, Каліфорнія, США).
Гомогенізація біоптатів, вестерн-блотинг та кількісне визначення βHB
Для всіх когорт людини та всіх зразків слизової оболонки товстої кишки в мишах зразки тканин готували, як описано раніше.11. Для кожної виявленої смуги щільність визначали кількісно і виражали у відсотках від загальної щільності всіх смуг цього конкретного розміру на одному і тому ж мембрана. В якості контролю завантаження використовували гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназу (GAPDH). Щодо антитіл див. Додаткову онлайн-таблицю 1.
Додатковий матеріал
Для кількісного визначення βHB аналізували гомогенати тканин per-RYGB та post-RYGB з «дієтичної когорти», використовуючи βHB Colorimetric Assay Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan, USA), і результати нормалізували до вмісту гомогенату білка.
Гістологія слизової оболонки товстої кишки
Зразки слизової оболонки товстої кишки, отримані у пацієнтів per-RYGB та post-RYGB (n = 5, випадковий вибір із підтверджуючої когорти), обробляли згідно стандартних процедур для підготовки зразків гістології. Коротко кажучи, біопсії фіксували у фосфатно-забуференному 4% формальдегіді, зневоднювали та вкладали у парафін. Вбудовані біопсії розрізали на ділянки 5 мкм. Для імунофлюоресценції зрізи регідратували, антигени отримували і зрізи блокували у 5% нормальній козячій сироватці (31872, ThermoFisher Scientific, Рокфорд, Іллінойс, США) перед інкубацією з первинними антитілами протягом ночі при 4 ° C. Потім предметні стекла промивали та інкубували з вторинним антитілом протягом 2 годин при кімнатній температурі та протифарбували фарбуванням Hoechst (H6024, Sigma-Aldrich). Щодо антитіл див. Додаткову онлайн-таблицю 1. Зрізи з блокуючим буфером замість первинного антитіла були включені як негативні контролі. Для загальної гістології фарбування H&E проводили за стандартними процедурами.