Регулювання клітинного циклу та ремоделювання цитоскелета є критичними процесами в харчуванні

Партнерська школа біологічних наук, Університет Ноттінгема, Саттон Бонінгтон, Лафборо, Великобританія

Афіліація Інституту харчування та здоров'я Роветта, Абердінський університет, Абердін, Великобританія

Партнерська школа біологічних наук, Університет Ноттінгема, Саттон Бонінгтон, Лафборо, Великобританія

Анджеліна Свалі,
Сара Макмаллен,
Хелен Хейс,
Лотарингія Азартні ігри,
Гаррі Дж. Макардл,
Саймон К. Ленглі-Еванс

Цифри

Анотація

Багато механізмів мають на меті пояснити, як харчові сигнали під час раннього розвитку проявляються як захворювання у дорослого потомства. Хоча вони описують процеси, що ведуть від дієтичної шкоди до розвитку справжньої патології, початкова основна причина програмного ефекту залишається незрозумілою. Щоб встановити основні рушії програмування, це дослідження мало на меті зафіксувати зміни ембріональних генів та білків у цілому ембріоні під час вживання їжі, а не за фенотиповими ефектами. Використовуючи перехресний дизайн двох добре встановлених моделей обмеження материнського білка та заліза, ми прагнули визначити передбачуваних загальних «воротарів», які можуть сприяти програмуванню харчування.

Як дефіцит білка, так і заліза у внутрішньоутробному періоді зменшував комплемент нефрону у дорослих самців щурів Wistar та Rowett з капюшоном (P2 Profiler PCR Array для клітинного циклу щурів (SABiosciences) було проведено додаткову перевірку в цих чотирьох групах. 500 нг попередньо підготовленої ембріональної РНК з груп RHL (CP, MLP, FeC та FeD; n = 6 для кожної) було здійснено зворотну транскрипцію за допомогою набору RT 2 First Strand (SABiosciences). ПЛР у режимі реального часу проводили на кДНК у зеленій суміші SYBR в індивідуальних пластинах із 384 лунками проаналізувати експресію 84 генів, ключових для регуляції клітинного циклу та ведення господарства.

Протеоміка.

Статистичний аналіз.

Загальну кількість нефрону, зміни експресії генів та площу та щільність білкової плями порівнювали між групами дієти/штаму одностороннім ANOVA у SPSS v16.0. У разі значного результату ANOVA (P Таблиця 1. Вага при народженні чоловіка, вага тіла 16 тижнів, вага лівої нирки 16 тижнів та співвідношення маси тіла нирок.

В обох штамах щурів, пренатальний білок (Wistar: P Рис. 1. Кількість нефронів у кожній дієті/групі штамів.

Дані є середніми ± SE. * P Таблиця 2. Кількість генів, що регулюється вгору і вниз з кожним вживанням їжі в порівнянні з контролем, у кожному штамі щурів (n = 8 тварин на групу; RHL - Лістер з капюшоном Роветта, MLP - матері з низьким вмістом білка, FeD - дефіцит заліза).

Аналіз шляху.

Аналіз шляхів проводився за допомогою платформи MetaCore для виявлення функціональних процесів, які були порушені внаслідок впливу ембріона на недоїдання матері. Цей аналіз базувався виключно на передбачуваних генах воротаря, ідентифікованих з мікрочипів (таблиця S2a – d). Не було достатньо специфічних для Wistar генів-воротарів, щоб знайти будь-які спільні шляхи до пренатального обмеження білка та заліза в цьому штамі. Однак для RHLs найбільш значущі шляхи стосувались ремоделювання цитоскелету, процесів клітинного циклу, апоптозу, передачі сигналів, метаболізму глікогену та процесів розвитку (рис. S1a). Обидва штами щурів, які зазнали пренатального обмеження білків, мали спільні шляхи, пов'язані з передачею сигналів з щілинною роботою, утворенням бульбашок, покритих клатрином, адгезією клітин та знову ремоделюванням цитоскелета (рис. S1b). Щодо дефіциту заліза, у обох штамів щурів змінилися загальні шляхи, як і у випадку, коли повідомлялося про RHL та обмеження білка (формування пухирців, покритих клатрином, ремоделювання цитоскелету, адгезія клітин та процеси розвитку), крім формування ендосом, транскрипції, скорочення м’язів та імунної системи відповідь (малюнок S1c).

Аналіз шляхів також виявив фактори транскрипції, які утворювали "концентратори" у загальних шляхах. Було складено список генів, пов'язаних з цими концентраторами, і це було збігово зі списком генів, визначених як передбачувані воротарі з мікрочипів. В цілому в обох списках з’явилося 36 генів, які вважалися найважливішими генними мішенями для подальшої роботи. Крім того, в якості мішеней були обрані 4 фактори транскрипції, які утворювали важливі «концентратори» в аналізі шляхів.

ПЛР у режимі реального часу.

ПЛР-аналіз у реальному часі для 36 генних мішеней та 4 факторів транскрипції, виявлених в аналізі мікрочипів та шляхів, як правило, не продемонстрував статистичної значущості результатів мікрочипів, хоча зміни показали загальну згоду (таблиці 3 та 4). Із тридцяти шести вибраних генів за допомогою ПЛР шістнадцять показали, що вони регулюються вгору або вниз з однаковим напрямком змін, зазначеним мікрочипом, в обох дієтичних образах у межах штаму або однаковій образі в обох штамах. З них один ген, Ube2c, продемонстрував значну регуляцію зниження (приблизно 50%) як для заліза, так і для білка в ембріонах від вагітності RHL. Ще чотири з цих шістнадцяти генів (Acvr2b, Nufip1, Rps20 та Taf13) виявили суттєві зміни між однією з двох пар у групі. Наприклад, Nufip1 суттєво регулювався у MLP проти CP у RHL (P Таблиця 3. Експресія відбору генів мікрочипів у ембріональній тканині, аналізована методом ПЛР у реальному часі, у відповідь на дефіцит заліза як у щурів Wistar, так і у Rowett з капюшоном Lister (FC = складка, RHL = Роуетт з капюшоном).

Шістнадцять з тридцяти шести генів погодились з мікрочипом для однієї з пар у групі, два суттєво, але показали протилежний напрямок змін в іншій парі (знову ж таки, часткова перевірка дослідження мікрочипів). Лише чотири з тридцяти шести генів виявили зміни в експресії, які були в протилежному напрямку до мікрочипів (Cyclin H, Mcart1, TBX3 і Tomm20). Чотири гени (Eef1g, Hint1, Rnf7 та Stx12) були запропоновані за допомогою ПЛР-аналізу в реальному часі воротами для іншої групи, ніж спочатку ідентифіковані мікрочипом (воротарі RHL, а не воротарі з обмеженням заліза). Два з них (Hint1 та Rnf7) тепер продемонстрували значні зміни між RHL CP та MLP. Чотири фактори транскрипції, які були обрані з аналізу шляхів та виміряні за допомогою ПЛР у реальному часі (SP1, C-Myc, HNF4a та p53), показали односпрямовані зміни у вираженні як з боку харчових образів у щурів RHL, так і наближення змін у вираженні статистична значущість принаймні для однієї з дієтичних зловживань у кожному випадку (P Таблиця 5. Вибір даних про експресію генів з масиву ПЛР RT 2 Profiler щурячого клітинного циклу (FC = складчасті зміни, RHL = Rowett Hooded Lister).