Регулювання негативних зворотних зв’язків опосередкованої RIG-I противірусної сигналізації індукованою інтерфероном ISG15

Знайдіть цього автора на Google Scholar
Знайдіть цього автора на PubMed
Шукайте цього автора на цьому сайті
Для листування: [email protected]

АНОТАЦІЯ

Клітини ссавців оснащені двома різними вродженими імунними механізмами, які виявляють вірусні інфекції та викликають індукцію інтерферонів типу I (ІФН) та прозапальних цитокінів (17). Позаклітинні вірусні нуклеїнові кислоти розпізнаються за допомогою Toll-подібних рецепторів (3, 7, 8 та 9) в ендосомі, тоді як внутрішньоклітинні нуклеїнові кислоти, такі як дволанцюжкова РНК (dsRNA) та 5′-трифосфатна РНК, розпізнаються індукований ретиноевою кислотою ген I (RIG-I)/асоційований з диференціацією меланоми білок гена 5 (MDA5 або Helicard) у цитоплазмі (2, 11-13, 31, 34). Позаклітинна dsRNA активує регуляторний фактор 3 NF-κB та IFN (IRF3)/IRF7 через Toll-подібний рецептор 3 та білок-адаптер TRIF, а внутрішньоклітинна dsRNA активує NF-κB та IRF3/IRF7 через RIG-I та білок-мітохондріальний адаптер MAVS/VISA/Cardif/IPS-1; обидва шляхи індукують вироблення IFN типу I (1, 18, 28, 35, 40).

Білок RIG-I є цитозольною DEXD/H коробчатою РНК-геліказою з властивостями зв'язування dsRNA або 5'-трифосфатної РНК (13, 31, 42). RIG-I активізує вироблення IFN типу I у відповідь на наявність внутрішньоклітинного вірусного генома РНК, такого як вірус Сендай або вірус гепатиту C (38, 42), і відіграє центральну роль у регуляції вироблення IFN у відповідь на вірусна інфекція у фібробластах та звичайних дендритних клітинах (15). Антивірусна реакція на РНК-вірусну інфекцію скасовується в клітинах мишачого ембріонального фібробласту (MEF) з дефіцитом RIG-I, і навпаки, реплікація вірусу обмежена в клітинах, що надмірно експресують RIG-I (42). Крім того, опосередкована RIG-I/MDA5 антивірусна сигналізація може порушуватися різними вірусними білками, що походять від вірусу гепатиту С, параміксовірусів або вірусу грипу (3, 8, 29).

Хоча спочатку повідомлялося, що миші з дефіцитом ISG15 демонструють нормальну передачу сигналів IFN та стійкість до вірусів везикулярного стоматиту (VSV) та лімфоцитотичних вірусів хоріоменінгіту (LCMV), ці миші нещодавно показали підвищену сприйнятливість до грипу, герпесу та вірусних інфекцій Sindbis ( 23, 30). Противірусна роль ISG15 також підтверджується спостереженнями, що надмірна експресія ISG15 пригнічує реплікацію вірусу Sindbis у багатьох органах мишей з дефіцитом рецептора IFN-α/β та захищає господаря від летальної дії, спричиненої вірусом (22). Серед нещодавно виявлених клітинних мішеней ISG15 є кілька індукованих IFN противірусних білків, включаючи PKR, MxA, HuP56 та RIG-I, що припускає, що кон'югація ISG15 може відігравати важливу регуляторну роль у опосередкованих IFN противірусних реакціях (26, 43). Однак миші з дефіцитом Ube1L, які не продукують кон'югати ISG15, демонстрували нормальну передачу сигналів IFN-α/β та противірусні відповіді на інфекції VSV та LCMV (20).

Білок RIG-I відчуває внутрішньоклітинні вірусні компоненти та ініціює противірусну реакцію, яка стимулює вироблення ІФН. IFN, у свою чергу, активує транскрипцію RIG-I, таким чином, генеруючи петлю позитивного зворотного зв'язку, що веде до накопичення білка RIG-I під час противірусної імунної відповіді. У той же час IFN-індукований Lgp2 перешкоджає розпізнаванню dsRNA білком RIG-I і, отже, функціонує як негативний регулятор (33, 41, 42). Тут ми повідомляємо про додаткову петлю негативного зворотного зв’язку, яка контролює клітинні рівні білка RIG-I за допомогою ISGylation білка, який індукується антивірусними або IFN-α/β сигналами. Ці результати виявили механізм, за допомогою якого опосередкована RIG-I сила сигналу може бути точно налаштована для підтримання балансу між вродженим захистом та гіперчутливістю під час противірусних відповідей.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Плазміди. КДНК миші ISG15 повної довжини отримували з печінки мишей, оброблених LPS, методом ПЛР зворотної транскриптази (RT-PCR) і згодом клонували в сайти EcoRI/XhoI плазміди pCS2-MT. Послідовності праймерів ПЛР були такими: 5′-CCGGAATTCGCAGCAATGGCCTGGGAC-3 ′ і 5′-CCGCTCGAGGGCACACTGGTCCCCTCC-3 ′. Повна довжина людської кДНК RIG-I була виділена з pEF-BOS-Flag-RIG-I (надано Такасі Фуджітою) і субклонована в плазміду pcDNA3.1/Hygro (Invitrogen). Точкову мутацію Flag-RIG-I (K172R) було введено з набором QuikChange-направленого мутагенезу відповідно до інструкцій виробника (Stratagene). Плазміди pCAGGS-HA-UBE1L та pFlag-CMV-UbcM8 люб’язно надані Донг-Ер Джангом (Дослідницький інститут Скриппса), а плазміди гемаглютиніну (HA) -Ub, прапор людини ISG15 та Flag-UBP43 Чін Ха Чунг (Сеульський національний університет, Корея). Були придбані плазміди pEGFP-N (Clonetech) та pISRE-luc (Stratagene), а плазміда люциферази pPRDIII-I люб’язно надана Кетрін А. Фіцджеральд (Університет Массачусетсу).

Антитіла та Вестерн-блот. Клітини лізували в буфері для лізису (150 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100, 0,1% додецилсульфат натрію [SDS], 0,5% дезоксихолат, 25 мМ Трис-HCl, рН 7,5), що містить 1 мМ дитиотреїтолу, 0,57 мМ фенілметилсульфонілфториду, 5 мкг лейпептину/мл, 2 мкг пепстатину А/мл, 5 мкг апротиніну/мл та 1 мМ бензамідину. Всі хімікати були придбані у Sigma. Загальний лізат клітин аналізували за допомогою денатурирующих (SDS) поліакриламідних гелів. Антитіла проти прапора (M2; Sigma), HA (Roche), Myc (Roche), актину (Santa Cruz Biotechnology), гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (GAPDH; Chemicon), зеленого флуоресцентного білка (GFP; Santa Cruz Biotechnology) та Білок RIG-I (R37; Immuno-Biological Laboratories Co.) був придбаний, а антитіла до людини RIG-I описані раніше (14). Імунореактивні сигнали розроблялися з використанням реагенту Super Signal (Пірс).