Рекомбінантна людська тканинна трансглютаміназа для діагностики та подальшого спостереження за дитячою целіакією
Анотація
Для виявлення дітей з ранніми ураженнями слизової та для швидкого спостереження необхідні високодискримінаційні маркери для целіакії. Метою цього дослідження було оцінити потенціал циркулюючих антитіл IgA та IgG протитканинної трансглютамінази (tTG) при діагностиці та спостереженні за дитячою целіакією. ІФА з використанням рекомбінантного людського tTG був використаний для вимірювання рівнів IgA та IgG анти-tTG антитіл у 226 зразках сироватки від 57 дітей із целіакією, підтвердженою біопсією, 29 суб'єктами контролю захворювання та 24 здоровими суб'єктами контролю. Усі зразки також аналізували на антиендомізієві антитіла (ЕМА). Рівні IgA та IgG анти-tTG антитіла корелювали зі станом ворсинкової структури тонкої кишки та рівнем IgA EMA у сироватці крові. Всі 25 зразків сироватки, отримані у нелікованих пацієнтів, містили антитіла IgA проти tTG, а 24 з 25 також мали IgA EMA. З зразків сироватки крові у 53 контрольних дітей у двох були антитіла IgA проти tTG, а у двох - IgA EMA. Діти віком до 5 років із нелікованою целіакією мали найвищі рівні сироватки IgA та IgG анти-tTG. Вже спостерігалося збільшення антитіл IgA проти tTG після 2 тижнів виклику глютену (стор
У пацієнтів з целіакією присутній великий спектр різних неспецифічних симптомів, і класичний опис захворювання, мабуть, є лише одним кінцем широкого спектру глютенових розладів. За визначенням, біопсія з проксимального відділу тонкої кишки є важливою для діагностики, а целіакія підтверджується принаймні однією біопсією кишечника, що виявляє атрофію ворсин (1). Тому діагностичні труднощі виникають, коли спостерігаються лише незначні патологічні зміни в морфології слизової оболонки або підвищена щільність ІЕЛ.
Підвищений рівень циркулюючих IgA та IgG AGA та IgA EMA є загальним явищем у пацієнтів із целіакією, і оцінка цих антитіл зазвичай використовується як допоміжний засіб для діагностики (2). Однак у деяких хворих на целіакію рівень АГА та ЕМА не підвищений, а при підвищенні різні рівні антитіл знижуються повільно, знижуючись лише через 3–12 міс обмеження глютену (3).
tTG був визначений в 1997 р. як головний антиген-мішень для ендомізіальних антитіл (4). tTG був продемонстрований у багатьох різних тканинах людини, таких як шкіра, печінка та слизова оболонка товстої кишки (5). tTG бере участь у адгезії клітин, складанні позаклітинного матриксу та механізмах загоєння ран (6–8), а гліадини пшениці можуть виступати субстратом для реакцій трансглютамінази (9, 10). Також було показано, що tTG вибірково дезамідує пептиди гліадину, що призводить до сильно підвищеної реактивності гліадин-специфічних кишкових Т-клітин (11, 12).
Вимірювання сироваткових антитіл IgA проти tTG можна використовувати як чутливі та специфічні маркери для нелікованої целіакії. Аналізи для виявлення антитіл IgA проти tTG мають чутливість від 92 до 100% і специфічність від 90 до 98% (13–20). Недавні звіти вказують на те, що аналізи tTG можна додатково вдосконалити, використовуючи людський tTG замість tTG морської свинки (18, 20–22).
Проте все ще існують певні сумніви щодо того, чи можна використовувати рекомбінантний людський tTG із такою ж діагностичною чутливістю та точністю, як аналіз EMA, і чи є рекомбінантний людський tTG більш чутливим та специфічним маркером, ніж EMA для целіакії у наймолодших дітей. Тому ми вивчили велику групу дітей з целіакією, підтвердженою біопсією, та суб'єктів контролю з іншими шлунково-кишковими захворюваннями, щоб дослідити клінічний потенціал рекомбінантного людського tTG у діагностиці та спостереженні за дитячою целіакією.
МЕТОДИ
Пацієнти.
До цього дослідження було включено 86 дітей із шлунково-кишковими симптомами та підозрою на порушення всмоктування. Захворювання діагностували у всіх дітей у відділенні педіатрії Університетської лікарні Уппсали, і під час розслідування целіакія виявилася у 57 дітей (31 дівчинка, 26 хлопчиків; середній вік 4 роки; діапазон 1–16 років). Діагноз підтверджено відповідно до оригінальних критеріїв Європейського товариства дитячої гастроентерології, гепатології та харчування (ESPGHAN) (23) або відповідно до переглянутих критеріїв діагностики целіакії у дітей (1).
Біопсії тонкої кишки проводили усім дітям, і в це дослідження було включено 25 біопсій нелікованих пацієнтів, 21 біопсія через 1–3 роки на безглютеновій дієті та 38 біопсія через 12 тижнів ГХ. У сорока дітей, що страждають на целіакію, пробу крові взяли після 2 тижнів ГХ. Всі діти, які зазнали проблем, мали нормальну дієту, що містить глютен, з рекомендацією, щоденне навантаження на клейковину має бути принаймні еквівалентним 2-3 шматочкам хліба.
Після детального діагностичного обстеження було виявлено, що у 29 дітей (16 дівчаток, 13 хлопчиків; середній вік 5 років; діапазон 1–18 років) були інші порушення, окрім целіакії. У цієї контрольної групи дві групи мали запальні захворювання кишечника, дев'ять - непереносимість коров'ячого молока, три - іншу непереносимість їжі та 15 - минущі шлунково-кишкові розлади. Усім суб’єктам контролю захворювання була проведена біопсія тонкої кишки, і в дослідження було включено 24 біопсії.
Двадцять чотири дитини (11 дівчаток, 13 хлопчиків; середній вік 5 років; діапазон 1-16 років) без жодних шлунково-кишкових симптомів та без родичів з целіакією служили здоровими контрольними суб'єктами. Всі дослідження пацієнтів та контрольних суб'єктів проводились відповідно до етичних правил лікарні.
Антитіла проти tTG.
Антитіла IgA та IgG до tTG у сироватці крові визначали за допомогою ІФА (дослідний зразок, Pharmacia Diagnostics, Фрайбург, Німеччина). Використовували смужки мікропланшетів, покриті рекомбінантним людським tTG, виробленим в системі Baculo/Sf9 в оптимальній концентрації. Рекомбінантний людський tTG мав чистоту 99% і пригнічував ендомізіальне зв’язування IgA із сироватками хворого на целіакію до стравоходу мавпи ефективніше, ніж tTG морської свинки, і давав еквівалентне інгібування природного tTG з еритроцитів людини (24).
Сироватки пацієнтів розводили у PBS з 1% BSA та 0,1% азидом натрію (PBS-BSA) до відповідних концентрацій. Додавали сироватку для пацієнта (100 мкл), і смужки інкубували протягом 30 хв при кімнатній температурі і тричі промивали PBS. Додавали кон'юговані з пероксидазою хрону антитіла IgA або IgG проти людини, і через 30 хв при кімнатній температурі планшети промивали тричі.
Додавали розчин субстрату, що містить 3,3 ′, 5,5 ′ тетраметилбензидину, і реакцію зупиняли через 10 хв при кімнатній температурі з 0,5 М H2SO4. Поглинання вимірювали при 450 нм.
У кожен аналіз були включені калібратори антитіл до tTG IgA, негативний контроль та заготовки розріджувачів. Концентрації антитіл виражали як AU на мілілітр, а зразки сироватки з абсорбціями вище найвищого калібратора додатково розбавляли та повторно аналізували. Внутрішньо- та міжаналітичні варіації були менше 10%.
Поріг для аналізів tTG визначали за робочими характеристичними кривими приймача (25), а рівні відсікання становили 4,7 а.е./мл для аналізу IgA tTG та 1,2 а.е./мл для аналізу tGG IgG.
Аналіз ЕМА.
IgA EMA аналізували за допомогою непрямої імунофлуоресцентної мікроскопії з використанням фіксованих криостатичних зрізів стравоходу мавп (Scimedx, Densville, NJ, USA) як антигенного субстрату (26). Сироватки пацієнтів розводили 1/10, а позитивні сироватки також досліджували у розведеннях 1/50, 1/100, 1/500 та 1/1000. Титр антитіл визначали як найбільше розведення в сироватці крові, що дає флуоресценцію.
Клітини, що продукують AGA.
Одноядерні клітини периферичної крові отримували з гепаринізованої венозної крові шляхом поділу на Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia Biotech, Упсала, Швеція). Клітинний фенотип визначали за допомогою сортувального аналізу клітин, активованого флуоресценцією, і 6-22% мононуклеарних клітин були CD45 + CD19 + (проточний цитометр FACSscan і MAb від Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).