Сприяє системна обробка кондиціонованими мезенхімальними стовбуровими клітинами кондиціонованого середовища
Анотація
Передумови
Мезенхімальні стовбурові клітини (МСК) мають великий потенціал як терапія інсульту, і раніше було показано, що вони сприяють відновленню на доклінічних моделях ішемії мозку. МСК секретують широкий спектр факторів росту, хемокінів, цитокінів та позаклітинних везикул - спільно названих секретомом. У цьому дослідженні ми вперше оцінили ефективність секретованого MSC-похідного секрету IL-1α на травму мозку та функціональне відновлення після ішемії головного мозку.
Методи
Інсульт індукували у самців мишей C57BL/6, використовуючи модель внутрішньосвітлової нитки оклюзії середньої мозкової артерії. Кондиціоноване середовище з грунтованих IL-1α MSC або носія вводили під час реперфузії або через 24 год після інсульту шляхом підшкірної ін’єкції.
Результати
Грунтоване лікування ILC-1α, отримане MSC, під час інсульту призвело до розвитку
Зменшення обсягу ураження на 30% через 48 годин і було пов’язано зі скромним поліпшенням збільшення маси тіла, 28-бальною неврологічною оцінкою та побудовою гнізда. Введення кондиціонованого середовища, отриманого від MSC, через 24 год після інсульту призвело до поліпшення побудови гнізда та неврологічного балу, незважаючи на відсутність різниці в обсязі ураження на 2 день після інсульту.
Висновки
Наші результати вперше показують, що введення кондиціонованого середовища з грунтованих IL-1α MSC призводить до поліпшення результатів поведінки незалежно від нейропротекції.
Передумови
Інсульт є значною глобальною проблемою охорони здоров'я, що призводить до приблизно 6,7 мільйона смертей щорічно [1]. Для 33 мільйонів людей, які живуть з інсультом, можливості лікування дуже обмежені і не повністю полегшують спричинену інвалідність [2]. Звідси великий попит на регенеративні терапії, що сприяють відновленню та покращенню інвалідності після ішемічного інсульту.
Було досліджено ряд стратегій попереднього кондиціонування in vitro для підвищення секретності MSC, включаючи 3D-культуру [15] та гіпоксичну попередню підготовку [16]. У нашій попередній роботі ми чітко демонструємо, що грунтування інтерлейкіном-1 альфа (IL-1α) веде секретом MSC до більш протизапального та протрофічного фенотипу, що може перетворитися на кращу терапію ішемічного інсульту [17]. В даний час ефект таких стратегій попереднього кондиціонування MSC не вивчений широко в доклінічних моделях інсульту. Дійсно, наскільки нам відомо, існує лише одне таке дослідження, яке оцінювало ефективність КМ, отриманого із зумовлених гіпоксією МСК [13], щодо відновлення моторики та нейропротекції на моделі ішемічного інсульту у щурів. Наші раніше опубліковані дані in vitro наочно демонструють, що грунтування IL-1α спонукає МСК до прорепаративного фенотипу. Отже, важливо підтвердити перевагу праймування IL-1α у відповідній парадигмі in vivo з детальною характеристикою поведінкового репертуару після інсульту, як це досліджувалося тут на мишій моделі оклюзії середньої мозкової артерії.
Методи
Характеристика MSC
Для характеристики MSC фарбували за допомогою набору аналізу hMSC BD Stemflow ™ (BD Biosciences, Великобританія) відповідно до інструкцій виробника. Потім клітини аналізували на проточному цитометрі FACSVerse (BD Biosciences, Великобританія) на позитивну експресію поверхневих маркерів CD73, CD90 і CD105 та негативну експресію CD11b, CD19, CD34, CD45 та HLA-DR, як визначено Міжнародним товариством клітинних Терапія як мінімальний критерій для МСК [18] (Додатковий файл 1: Рисунок S1). Позитивні ворота встановлювали за допомогою флуоресценції мінус один контроль. Мультипотентність MSC також оцінювали за допомогою комерційно доступного набору (R&D Systems, Великобританія). Коротше кажучи, МСК культивували протягом 21 дня в диференційованих середовищах із зміною середовища кожні 2–3 дні. Адипоцити фарбували маслом червоного O (Millipore, Великобританія), а остеоцити - алізарином червоного (Millipore, Великобританія). Гранули хрондоцитів розрізали на зрізи по 30 мкм за допомогою мікротома для заморожування на санях (Bright Instruments, Великобританія), потім фарбували толуїдиновим синім (Sigma-Aldrich, Великобританія). Зображення отримували за допомогою перевернутого мікроскопа (Olympus CK X31) та камери Moticam 2300, підключеної до програмного забезпечення Motic Images Plus 2.0 ML (Motic, Гонконг).
Культура мезенхімальних стовбурових клітин
Для всіх експериментів використовували пасаж 5–6 MSC, отриманих з кісткового мозку людини від 22-тижневого донора плода (3H Biomedical, Швеція). МСК культивували як моношар у колбах для культури тканин (Корнінг, Великобританія) в середовищі MesenPRO RS (Invitrogen, Великобританія), доповненій 1% пеніциліном/стрептоміцином та 2 мМ глютаміном. Ростове середовище змінювали кожні 4–5 днів, поки клітини не злилися на 70–80%. Потім MSC дисоціювали з 0,5% трипсином-ЕДТА (Sigma-Aldrich, Великобританія) і підраховували. Для препарату CM (αCM) з грунтовкою IL-1α MSC висівали в 6-лункові планшети (Корнінг, Великобританія) при щільності 1,75 × 10 5 клітин/лунку та інкубували протягом 24 годин. Потім MSC обробляли 10 нг/мл людського рекомбінантного IL-1α (R&D Systems, Великобританія) протягом 5 хв. Клітини двічі промивали PBS, після чого додавали безсироваткову середовище MesenPRO RS (без добавки). Через 24 год збирали αCM, клітинний залишок видаляли за допомогою шприцевих фільтрів 0,22 мкМ (Millipore, Великобританія) та 10 разів концентрували за допомогою відцентрових концентраторів 3000 MWCO Vivaspin (Generon, UK) згідно з інструкціями виробника. Для транспортного засобу безсироваткове середовище MesenPRO RS також концентрували в 10 разів. Для всіх експериментів in vivo 400-мкл кондиціонованих обробок, отриманих із 3,5 × 105 клітин, готували заздалегідь і зберігали при - 80 ° C.
Експерименти in vivo
Тварини
Усі процедури для тварин проводились відповідно до переглянутого Закону про тварини (про наукові процедури) 1986 року за ліцензією проекту Міністерства внутрішніх справ (Великобританія) та схвалено місцевою Комісією з етичного контролю за захистом тварин. Тварин групували в клітинах Sealsafe Plus Mouse з індивідуальною вентиляцією (Techniplast, Італія) при 21 ± 1 ° C, вологості 55 ± 10% при 12-годинному циклі світло-темно. Усі клітки були забезпечені гніздовим матеріалом Sizzle Nest (Datesand Ltd., Великобританія) та картонними збагачувальними трубками (Datesand Ltd., Великобританія). Миші мали вільний доступ до стандартної дієти для гризунів (SDS, Великобританія) та води. Мишей привчали до закладу принаймні за 1 тиждень до початку експериментальних робіт.