Ваготомія зменшує очищення інсуліну у мишей із ожирінням, запрограмованих за допомогою низькобілкової дієти в підлітковому віці

1 Університет Кампінасу (UNICAMP), Кампінас, Іспанія, Бразилія

2 Державний університет Західної Парани (UNIOESTE), Каскавель, PR, Бразилія

Анотація

1. Вступ

Вважається, що низьке або високе споживання калорій матерями та батьками пов’язане з порушенням гомеостазу глюкози та інсуліну у їхніх нащадків [1]. Мишей утримували на дієті з низьким вмістом білка на ранніх стадіях і годували на контрольній дієті у дорослому віці, а також демонстрували наздоганяючий ріст, пов'язаний з непереносимістю глюкози [2]. Дійсно, економічні покращення в країнах, що розвиваються, впродовж останніх десятиліть поставили людей у подібні умови. У цих суб'єктів прийом нормальної або висококалорійної дієти у зрілому віці, після періоду обмеження калорій на початку життя, збільшує ризик розвитку метаболічних захворювань [3, 4]. Ці ранні екологічні ситуації відомі як прогностична адаптивна реакція або економна гіпотеза фенотипу, постульована Хейлзом та Баркером у 1992 р. [1].

Ми показали, що у мишей, які харчуються в підлітковому віці дієтою з низьким вмістом білка, а потім дорослою їжею з високим вмістом жиру, розвивається непереносимість глюкози, резистентність до інсуліну та знижена секреція інсуліну порівняно з тими, які харчуються дієтою з високим вмістом жирів протягом усього експериментальний період [5]. Це вказує на те, що метаболічне програмування, спричинене недоїданням у ранньому віці, погіршує гомеостаз інсулін-глюкоза більшою мірою, ніж саме ожиріння. Крім того, недоїдають та ожиріння миші можуть виявляти травми нейронів гіпоталамусу, які контролюють споживання та витрату енергії [6]. Миші, що не переносять глюкозу, піддані дієті з низьким вмістом білка на початку життя та контрольній дієті у зрілому віці, також виявляють підвищену вагусну активність, що свідчить про участь парасимпатичної нервової системи в гомеостазі глюкози [2].

Програмування метаболізму можна пояснити концепцією розвитку здоров’я та захворювань (DOHaD), яка описує за допомогою кількох досліджень, як ранні фактори навколишнього середовища, такі як харчування, можуть викликати фізіологічні зміни у плода, новонародженого, підліткового віку та дорослих, що призводить до програма довгострокових наслідків після пологів [7–9].

Таким чином, ми прагнули дослідити вплив субдіафрагмальної ваготомії на чутливість до інсуліну, секрецію та деградацію у запрограмованих на метаболізм мишей, індукованих дієтою з низьким вмістом білка на ранніх стадіях життя з подальшим вживанням дієти з високим вмістом жирів у зрілому віці.

2. Матеріали та методи

2.1. Тварини

Усі експерименти на тваринах проводились відповідно до протоколів, затверджених Комітетом з догляду та використання тварин Університету Кампінасу (UNICAMP) (номер затвердження: 3379-1). Самців мишей C57Bl/6 отримували від UNICAMP і підтримували при 22 ± 1 ° C протягом 12 годин циклу світло-темрява. Тридцятиденних мишей годували протягом 4 тижнів нормальною білковою дієтою (14% білка) (група NP) або дієтою з низьким вмістом білка (6% білка) (група LP). Після цього мишей LP розподіляли на три групи: LP, яку утримували з низьким вмістом білка; LP + HF, які почали отримувати дієту з високим вмістом жиру (35% жиру) протягом 8 тижнів; та LP + HFvag, який був підданий ваготомії, а також почав отримувати дієту з високим вмістом жиру протягом 8 тижнів. Дієтичні склади були описані в попередньому дослідженні [10].

2.2. Процедура піддіафрагмальної ваготомії

Через 4 тижні після споживання дієти з низьким вмістом білка мишей LP + HF піддавали піддіафрагмальній вантотомії шлунка (група LP + HFvag) або фіктивній операції (LP + HF). Для цієї процедури 12-годинних голодуючих мишей знеболювали сумішшю кетаміну та ксилазину (0,06 та 0,02 мг/г через внутрішньовенне введення, відповідно; Vetbrands®, Paulínia, SP, BRA). Згодом шлунок та стравохід були екстеріорізовані з очеревинної порожнини, і обидва, тильний та піддіафрагматичний вагусний стовбур, відокремлені від стравоходу та відрізані. Підроблені миші проходили ті самі процедури, але блукаючий нерв залишався цілим. Наприкінці експериментального періоду для підтвердження піддіафрагмальної ваготомії затримку їжі в шлунку від усіх груп мишей оцінювали за співвідношенням між вагою шлунка на масу тіла (БТ), згідно з попереднім дослідженням [11–13].

2.3. Тест на толерантність до внутрішньочеревної глюкози та інсуліну

Для внутрішньочеревного (ip) тесту на толерантність до глюкози (ipGTT) мишей голодували протягом ночі (12 год), а з кінчика хвоста відбирали пробу базальної крові (т = 0 хв). Мишам отримували внутрішньовенне введення 2 г/кг глюкози (Labsynth, Сан-Паулу, Бразилія), розчиненої у сольовому розчині (0,9% NaCl мас./Об.), І додаткові зразки крові реєстрували через 15, 30, 60 та 120 хв. Глюкозу реєстрували за допомогою ручного глюкометра (Accu-Chek Performa II, Roche Diagnostics, Швейцарія). Для тесту на толерантність до ip-інсуліну (ipITT) мишей голодували протягом 2 годин і вводили ip-інсулін (Humulin R, Eli Lilly, штат Індіанаполіс, США) (1 Од/кг). Кров брали безпосередньо перед ін'єкцією інсуліну (т = 0 хв) і в рази 3, 6, 9, 12, 15, 18 і 21 хв через відрізання хвоста за допомогою ручного глюкометра. Рівень зникнення глюкози (КITT) розраховували, як описано раніше [14, 15].

2.4. Очищення інсуліну

Під час ipGTT проби крові відбирали з кінчика хвоста перед навантаженням глюкозою (т = 0) та через 15 та 60 хв після введення глюкози та поміщають у мікропробірки, що містять антикоагулянтний гепарин. Пробірки центрифугували при 1100

, 15 хв, 4 ° C, і плазму збирали і зберігали при -80 ° C. Інсулін та С-пептид вимірювали за допомогою інсуліну для щурів/мишей або С-пептиду 2 ELISA Kit (кат. EZRMI-13K та EZRMCP2-21K, EMD Millipore, США, відповідно), відповідно до інструкцій виробника. Кліренс інсуліну оцінювали за співвідношенням С-пептид: інсулін, як описано раніше [16].

2.5. Ізоляція острівців та GSIS

Острівці були виділені шляхом перетравлення колагенази підшлункової залози, як описано Boschero et al. 1995. Для статичних інкубацій групи з п’яти острівців попередньо інкубували протягом 30 хв при 37 ° C з 500 μL буфера Кребса (KBB) із таким складом: 115 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2,56 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 10 мМ NaHCO3, 15 мМ HEPES; з добавкою 5,6 мМ глюкози та 3 г бичачого сироваткового альбуміну (BSA) на літр; і збалансований із сумішшю 95% O2-5% CO2 для забезпечення рН 7,4. Після цього це середовище замінювали свіжим буфером, і острівці інкубували протягом 1 години з 1 мл KBB, що містить 5,6, 11,1 або 16,7 мМ глюкози. В кінці інкубаційного періоду супернатанти збирали і підтримували при -20 ° C. Для вмісту інсуліну на острівцях збирали групи з п’яти острівців, переносили їх у пробірки, що містять 1 мл деіонізованої води, та гомогенізували за допомогою сонікатору (Brinkmann Instruments, США). Інсулін вимірювали за допомогою RIA з використанням людського інсуліну, міченого 125 I в якості індикатора, стандартного інсуліну щурів (Crystal Chem Inc., США) та антитіл до інсуліну щурів (пожертвував д-р Леклерк-Мейер, Вільний університет Брюсселя, Бельгія). Метод вугілля декстран застосовувався для відокремлення вільного інсуліну від інсуліну 125 I, зв’язаного з антитілами.

2.6. Вестерн-клякса

2.7. Статистичний аналіз

Дані представлені як середнє значення ± SEM, і відмінності вважалися значними при

. Порівняння проводили за допомогою одностороннього ANOVA з подальшим тестом Тукі. Тести проводились із використанням GraphPad Prism, версія 5.0 для Windows (GraphPad Software Inc., Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Розмір вибірки визначали з урахуванням ефекту розміру. Для виключення помилок типу II використовували двосторонню статистику з рівнем значимості 5% та потенцією 0,98. За цих умов рекомендований розмір вибірки буде