Вибірковий вплив фосфатидилхоліну на лізис адипоцитів

Джи-Янг Кім

1 Відділ біомедичних наук Медичного коледжу Ульсана, Інститут наук про життя Асана, Медичний центр Асана, Сеул, Корея

2 Біомедичний технологічний інститут, Ульсанський університет, Медичний коледж, Сеул, Корея

Мін-Сео Квон

2 Біомедичний технологічний інститут, Ульсанський університет, Медичний коледж, Сеул, Корея

Син Джунгюн

3 Кафедра біологічної хімії, Корейський університет науки і техніки, Теджон, Корея

4 Центр допінг-контролю, Корейський інститут науки і техніки, Сеул, Корея

Санг-Вук Кан

Пісня Youngsup

Концептуалізація: YS JK.

Формальний аналіз: JK YS.

Придбання фінансування: YS.

Розслідування: JK MK HS.

Методологія: YS JK SK.

Адміністрація проекту: YS SK.

Ресурси: JK MK.

Нагляд: YS.

Перевірка: JK MK.

Візуалізація: JK YS.

Написання - оригінальний проект: YS JK.

Написання - огляд та редагування: YS.

Пов’язані дані

Всі наші дані містяться в папері та допоміжних інформаційних файлах

Анотація

Вступ

Більше 30% населення США страждає ожирінням. Це серйозний фактор ризику, який може спричинити або посилити багато метаболічних розладів, включаючи серцево-судинні захворювання, дисліпідемію та діабет. Це також було пов'язано з проблемами психічного здоров'я; спостерігається збільшення поширеності депресії серед пацієнтів із ожирінням [1], що, в свою чергу, негативно впливає на багато аспектів життя і може призвести до порушення соціальної поведінки, розладів харчування та зниження самооцінки [2]. Тому зменшення жирової тканини важливо для вирішення медичних питань, а також для естетичних цілей.

У цьому дослідженні ми використовували як методи in vitro, так і модель in vivo на щурах для порівняння жирознижувальної активності PPC та DC та перевіряли їх адипоцитарну специфічність.

Матеріали і методи

Реагенти

PPC (97,8% чистого поліенового фосфатидилхоліну) та DC натрію (99,1% чистого) були придбані у Lipoid (Lipoid Kosmetik AG, Швейцарія) та NZP (New Zealand Pharmaceuticals, Ltd., Нова Зеландія), відповідно. Формула PPC/DC, показана на рис. 1, містить 5% PPC і 2,4% DC натрію у воді, а розчин DC, показаний на рисунку, містить 2,4% DC натрію. Для обробки PPC та DC у преадипоцитах, адипоцитах та щурах 3T3L1 готували 5% розчини PPC та DC у етанолі та воді відповідно.

A. Преадипоцит 3T3L1 та життєздатність клітин адипоцитів B. вимірювали через вісім годин після обробки різними дозами формули PPC/DC або DC лише за допомогою тесту МТТ. Зразки білка з преадипоцитів C. 3T3L1 та адипоцитів D. після 0,01% або 0,1% формули PPC/DC або обробки DC протягом восьми годин, були підготовлені та проаналізовані методом Вестерн-блот.

Тварини та експериментальний дизайн

МРТ-аналіз

Було зроблено приблизно 10 знімків, щоб покрити всю область пахової жирової прокладки для кожної тварини до ін’єкції та через 7, 14 та 28 днів після ін’єкції. Після збору всіх зображень проводили сліпий аналіз для вимірювання площі пахового жиру, використовуючи imageJ з порогом інтенсивності жиру (інтенсивності білого), встановленим на 10000.

Культура 3T3L1 та диференціація адипоцитів

Клітинна лінія 3T3L1 культивувалася в мінімальному основному середовищі Дульбекко, доповненому 10% фетальною бичачою сироваткою (HyClone, Logan, UT, США) та 1% пеніциліну-стрептоміцину. Для диференціації адипоцитів 3 × 10 5 клітини 3T3L1 висівали в 12-лункові планшети. Через два дні після посіву адипогенез був індукований переходом на культуральне середовище 3T3L1, доповнене 4 мг/мл дексаметазону, 0,5 мкМ IBX, 0,5 одиниці/мл гумуліну (Lilly, США) та 100 нМ розиглітазону (Рош, Швейцарія). Через два дні після впливу клітин на адипогенне індукційне середовище його замінили свіжим культуральним середовищем 3T3L1, що містить лише 0,5 одиниці/мл гумуліну та 100 нМ розиглітазону. Свіже середовище додавали кожні два дні протягом наступних 5 або 6 днів. Адипогенез визначали за допомогою світлової мікроскопії оцінки утворення ліпідної вакуолі та фарбування Олійно-червоним О.

Аналіз життєздатності клітин

Розчини PPC або DC (5%) розбавляли, отримуючи 1000 × для кожної концентрації, і наносили на культуральне середовище клітин, так що кінцева концентрація розчинника (етанолу для PPC та води для DC), що зазнав впливу на клітини, становила 0,1 % Життєздатність клітин оцінювали за допомогою аналізу МТТ. Коротко кажучи, за день до експерименту 10 × 10 4 клітин висівали в 24-лункові планшети для культури тканин. У день експерименту додавали PPC, DC або контроль (етанол як контроль PPC та воду як DC), як зазначено у легендах на малюнку; за годину до закінчення експерименту застосовували 5 мг/мл МТТ (Duchefa Biochemie, Нідерланди). Клітини промивали PBS, і 150 мкл ДМСО застосовували протягом 15 хв для вилучення барвника. Життєздатність клітин оцінювали шляхом вимірювання поглинання при 565 нм за допомогою планшетного зчитувача (BioTek, США).

Вестерн-блот і антитіла

За день до експериментального дня клітини преадипоцитів 3 × 10 5 3T3L1 висівали в 12-лункові планшети і застосовували формулу PPC/DC, PPC або DC, як зазначено на малюнках. Преадипоцити 3T3L1 диференціювали на адипоцити відповідно до протоколу диференціації адипоцитів, зазначеного вище. Після підтвердження диференціації адипоцитів шляхом візуалізації утворення вакуолі ліпідів за допомогою фарбування Oil Red O, диференційовані адипоцити обробляли формулою PPC/DC, PPC або DC. Зразки білка готували в 120 мкл буфера для лізису (10 мМ Трис (рН 7,4), ЕДТА та 1% SDS з добавкою інгібітора протеїнази (Roche)) на лунку з 24 лунковими планшетами. Для імуноблот-аналізу первинні антитіла до PPARγ, C/EBPα, FABP4, α-тубуліну, HSP90 α/β (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Санта-Крус, Каліфорнія, США), PARP, каспази-3 та чутливі до фосфо-гормону використовували ліпазу (HSL) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) та вторинні антитіла для кон'югованих з HRP анти-кролячих або анти-мишачих IgG (Thermo Fisher, США).