Видалення серцевого фібробласту GRK2 покращує скорочувальну здатність та реконструкцію
Меріл С. Вудолл
1 Центр трансляційної медицини, Медична школа Льюїса Каца, Університет Темпл, Філадельфія, Пенсільванія, США
Бенджамін П. Вудолл
1 Центр трансляційної медицини, Медична школа Льюїса Каца, Університет Темпл, Філадельфія, Пенсільванія, США
Ерхе Гао
1 Центр трансляційної медицини, Медична школа Льюїса Каца, Університет Темпл, Філадельфія, Пенсільванія, США
Анкай Юань
1 Центр трансляційної медицини, Медична школа Льюїса Каца, Університет Темпл, Філадельфія, Пенсільванія, США
2 Кафедра кардіології, лікарня Рень Цзі, Медичний факультет, Шанхайський університет Цзяо Тонг, Шанхай, Китай.
Вальтер Дж. Кох
1 Центр трансляційної медицини, Медична школа Льюїса Каца, Університет Темпл, Філадельфія, Пенсільванія, США
Пов’язані дані
Анотація
Обґрунтування
G-білкова рецепторна кіназа 2 (GRK2) - важлива молекула, що регулюється після ушкодження міокарда та під час серцевої недостатності. Специфічна для міоцитів втрата GRK2 до і після ішемічного ураження міокарда покращує серцеву функцію та реконструкцію. Фібробласт серця відіграє важливу роль у відновленні та реконструкції після ішемії серця; значення GRK2 у цих подіях не досліджувалось.
Об’єктивна
Метою цього дослідження є з'ясування наслідків видалення GRK2 у серцевому фібробласті після пошкодження ішемії/реперфузії (I/R) in vivo.
Методи та результати
Ми демонструємо, використовуючи індуковані тамоксифеном, специфічні для фібробластів миші-нокаутери GRK2, що втрата GRK2 надає захисну перевагу над контрольними мишами після пошкодження міокарда. Миші-нокаути з фібробластом GRK2 представлені зменшеним розміром інфаркту та збереженою серцевою функцією через 24 години після введення/введення, що продемонстровано збільшенням фракції викиду (58,1 ± 1,8% проти 48,7 ± 1,2% у контрольних групах, p Ключові слова: Ішемія міокарда/реперфузійна травма, G-білкова рецепторна кіназа 2, серцевий фібробласт, фіброз, запалення
ВСТУП
Пошкодження ішемії/реперфузії (I/R) активує «стерильну» запальну реакцію, коли нейтрофіли вербуються до ішемізованої зони некротичними міоцитами та активними формами кисню (АФК). 7 Надмірна інфільтрація нейтрофілів у місці інфаркту вважається шкідливою для виживання міоцитів, оскільки нейтрофіли також секретують АФК, ще більше посилюючи руйнування клітин та тканин. 8 Розуміння запалення та реконструкції після пошкодження В/В важливо для розробки нових методів лікування; численні дослідження продемонстрували, що пригнічення екстравазації нейтрофілів зменшує пошкодження тканин і зменшує розмір інфаркту. 9-11 Нас цікавлять серцеві сигнали та клітинний зв'язок між міоцитами та фібробластами, які можуть регулювати або змінювати пошкодження тканин після пошкодження I/R.
Хоча регуляція GPCRs в міоцитах під час ішемічної травми була широко вивчена, передача сигналів GPCR фібробластів під час I/R пошкодження та фокус цього дослідження, GPCR кіназа 2 (GRK2), не були добре охарактеризовані. Основна роль GRK2 полягає у фосфорилюванні активованих агоністами GPCR і спрямуванні їх на β-арестин-опосередковану інтерналізацію; у серці GRK2 регулюється в міоциті після пошкодження, і його посилена активність спрямована на β-адренергічний рецептор (βAR) для модуляції скоротливості. 12-13 десятиліть досліджень виявили згубні наслідки підвищеної активності GRK2 при серцевих захворюваннях і надали широкі докази того, що втрата експресії GRK2 міоцитів або її пригнічення до або після серцевого пошкодження є корисним для скоротливості міокарда та реконструкції серця. 14-16 Більш пізні дослідження також розширили універсальність GRK2, окресливши неканонічні ролі в регуляції eNOS 17,18, функції мітохондрій 19,20 та передачі сигналів про інсулін. 21
В даний час мало відомо про функцію GRK2 в серцевому фібробласті. У цьому дослідженні ми прагнули вивчити, чи буде втрата фібробластів GRK2 вигідною чи шкідливою для серцевої функції після гострої ішемічної травми in vivo. За допомогою індуцибельних та умовних мишей з нокаутом GRK2 (KO) ми піддали мишам GRK2 KO, характерним для фібробластів, пошкодження міокарда та дослідили ефекти, пов'язані з функцією серця, фіброзом та запаленням. Наші результати чітко показують, що в гострій ситуації втрата фібробластів GRK2 сприятлива для серцевої функції та ремоделювання, і що це може бути пов’язано з різницею в рекрутингу запальних клітин у ранні години після реперфузії. Ми також провели експерименти in vitro на свіжоізольованих серцевих фібробластах новонароджених щурів та дорослих мишей, щоб отримати уявлення про те, як фібробласт може впливати на виживання міоцитів та запалення серця in vivo.
МЕТОДИ
Дослідні тварини
Для отримання індуцибельних, специфічних для фібробластів мишей GRK2 KO мишей Collagen1α2-CreER (T) 22 (Jackson Labs Stock # 029235) схрещували з мишами GRK2 fl/fl 23 (Jackson Labs Stock # 012458). Цуценят повторно схрещували для отримання мишей Collagen1α2-CreER (T)/GRK2 fl/fl (іменовані як GRK2 fKO). Мишей GRK2 fl/fl використовували в якості контролю дикого типу (WT). Тамоксифен (Sigma T5648) вводили внутрішньочеревно (ІП) щодня протягом 10 днів із 40 мг/кг/добу. Всі дослідження на тваринах проводились із схвалення Комітету з догляду та використання тварин при Університеті Темпл.
Виділення серцевих фібробластів та міоцитів дорослих мишей
Серця витягували у мишей> 2-3 місяців і обробляли, як описано раніше. 24
Виділення клітин кісткового мозку та препарат лізату
Стегно було видалено у мишей> 2-3 місяців. Зміст промивали за допомогою буферованого сольового розчину Хенка (Corning 21-023-CV), шприца та голки 27 калібру. Клітини кісткового мозку центрифугували і промивали 1X PBS. Клітини ресуспендували в буфері RIPA, доповненому інгібіторами протеази, обробляли ультразвуком і центрифугували для видалення клітинних залишків.
Виділення гладких м’язів судин та препарату лізату
Грудна аорта була виділена від мишей віком> 2-3 місяців. Після промивання в 1X PBS на аорти реагували в буфері RIPA, доповненому інгібіторами протеази, обробляли ультразвуком і центрифугували для видалення клітинних залишків.
Виділення серцевих фібробластів щурів у новонароджених
Серцеві фібробласти щурів у новонароджених виділяють як побічний продукт виділення міоцитів серця у щурів у новонароджених, як це було описано раніше 17 .
Імуноблотинг
Антитіла до GRK2 та GAPDH були від Санта-Крус. Антитіла до фосфо-AKT та загальні AKT були отримані від Cell Signaling.
Модель in vivo ішемії/реперфузійної травми
Ішемія/реперфузійна травма була виконана, як описано раніше. 25 Розмір інфаркту вимірювали, як описано раніше. 26
Трансторакальний ехокардіографічний аналіз
Трансторакальну двовимірну ехокардіографію проводили сліпо, як описано. 25
Кінцевий гемодинамічний аналіз серцевої функції
Гемодинамічний аналіз проводили сліпим, як описано раніше. 25
Вимірювання апоптозу міокарда
Апоптоз міокарда оцінювали за допомогою фарбування TUNEL. 18
Оцінка фіброзу міокарда
Рівні колагену вимірювали за допомогою набору для фарбування Trichrome Masson (Sigma HT15) та набору для аналізу гідроксипроліну (Sigma MAK008) без модифікацій.
Вимірювання рівнів цАМФ
Серцеві фібробласти щурів у новонароджених обробляли 10 мкМ ізопротеренолу протягом 15 хвилин. Рівні cAMP вимірювали за допомогою циклічного набору для аналізу AMP XP (Cell Signaling 4339) без модифікацій.
Імунофлюоресценція
Серця збирали через 72 години після реперфузії, фіксували на ніч у 4% параформальдегіді, вкладали у парафін і розрізали на довгій осі на секції 6um. Після депарафінізації, регідратації та вилучення антигену за допомогою розчину для викриття антигенів Vector (Vector Labs H3300) зрізи блокували в 10% FBS/1X PBS. Первинне антитіло (α-SMA, Sigma A5228) інкубували зі зрізами протягом ночі при 4 ° C. Вторинне антитіло (Life Technologies A21463) застосовували протягом 1 години при кімнатній температурі. Зрізи обробляли кріпильним носієм DAPI і закривали кришку. Інтенсивність флуоресценції вимірювали за допомогою ImageJ. Для фарбування серцевих фібробластів щурів новонароджених клітини обробляли метанолом протягом 15 хвилин при -20 ° С, промивали та блокували протягом 1 години при кімнатній температурі в 5% BSA/PBS. Антитіло P65 (Cell Signaling 6956) інкубували протягом ночі при 4 ° C, а вторинне антитіло (Life Technologies) застосовували протягом 1 години при кімнатній температурі. Зрізи обробляли кріпильним носієм DAPI та закривали кришку. Клітини підраховували, використовуючи Image J, принаймні за п’ять полів на групу. Всі зображення імунофлюоресценції були зроблені за допомогою мікроскопа Nikon Ti.