Відділення лімфатичних вузлів, що розділяється, диктує адаптаційні імунні реакції кишечника bioRxiv

Анотація

Основна функція кишечника полягає в перетравленні та засвоєнні харчових поживних речовин за допомогою абсорбційного епітелію та судинної системи судин і лімфатичної системи, а також мікробіома 6. Відбір поживних речовин та абсорбційна здатність змінюються по кишечнику; більшість харчових поживних речовин поглинається ворсинками верхньої частини тонкої кишки (дванадцятипала кишка (D) і тонка кишка (J)) і меншою мірою нижньою частиною тонкої кишки (клубова кишка, I), тоді як щільна мікробіота в I і товстій кишці ( В) опосередковує подальше виділення поживних речовин. У кишечнику також знаходиться найбільший імунний відсік в організмі, якому покладено завдання забезпечити стійкість до токсинів та вторгнення патогенних мікроорганізмів, зберігаючи при цьому толерантність до дієтичних та мікробіотичних антигенів, або за допомогою місцевої дії, або за допомогою лімфатичного трафіку до стікаючих кишечнику млМН для реалізації адаптивних реакцій, 9. Ми прагнули зрозуміти, як компартменталізований лімфодренаж кишечника сприяє організованій імунній відповіді в цьому складному середовищі.

відділення

Наші дані розкривають механізм, за допомогою якого кишкова імунна система одночасно обробляє регуляторну та протизапальну реакції: шляхом анатомічного розділення цих реакцій на різні, функціонально спеціалізовані млН. Ефективний дренаж дієтичних антигенів у лімфатичні вузли, що сприяють толерантності, пов’язані з проксимальним відділом кишечника, сприяє розумінню питань профілактики харчової алергії, а також пов’язують дуоденальну інфекцію та дисбіоз як порушення навколишнього середовища, які можуть змінити алергічний результат. Цілком імовірно, що пероральна вакцинація, як правило, викликає зниження імунної відповіді 30 за цим самим механізмом. Однак толерогенний шлях дванадцятипалої кишки може бути використаний терапевтично для індукції толерантності до недоступних інакше джерел протизапального антигену, таких як дисбіотична клубова кишка або бактерії товстої кишки при запальних захворюваннях кишечника.

Методи

Самки щурів вістар 6-10 тижнів були придбані у річки Чарльз. Догляд за тваринами та експериментування відповідали керівним принципам NIH і були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин при Рокфеллерівському університеті.

Реагенти

Наступні реагенти були придбані у Sigma: бензиловий ефір (108014), дихлорметан (270997), Fast Green FCF (F7252), гепарин (H3393), омепразол (O104), Pluronic L-81 (435430), пірантел памоат (P6210) Овальбумін (ступінь VI, A2512; ступінь III A5378) та ванкоміцин (V2002). Овалбумін без LPS був з Гіглосу, Німеччина (Кат. № 77161). 3 H-ретинол і Na 125 I були від Перкіна-Елмера.

Антитіла, фарбування та проточна цитометрія

Очищення тканин, мікроскопія світлового аркуша та реконструкція зображень

Що стосується очищення та фарбування тканин, протоколу iDISCO було дотримано, як описано на веб-сайті, що постійно оновлюється: http://idisco.info із наступними особливостями: Тканини фарбувались у первинних та вторинних антитілах протягом 4 днів кожна і були вбудовані в 1 % агарози-TAE до остаточної дегідратації. Блоки знімали за допомогою LaVision Ultramicroscope II та програмного забезпечення. Зображення реконструювали за допомогою програмного забезпечення Imaris 8.

3 Біорозподіл H-ретинолу

Мишей голодували протягом 3 годин перед введенням 150 мкл PBS з або без 5 мкл утворення хіломікрону, що інгібує Pluronic L-81, після чого 1 мкСі 3 H-ретинол у 100 мкл оливкової олії через 30 хвилин і відбирали проби у зазначені моменти часу. Сироватка бралася з підщелепної вени (системної) або з ворітної вени. Лімфу збирали з грудної протоки під наркозом ізофлурану за допомогою виготовленої на замовлення скляної голки (знімач мікропіпетки, Sutter Instrument). Розсічені органи зважували до лізису шляхом механічного порушення в 0,5 мл гіпертонічному буфері лізису з 1% Triton-X 100, лізаті, змішаному з 7 мл сцинтиляційного коктейлю Ultima Gold (Perkin Elmer), та накопиченню радіоактивності, виміряної на сцинтиляційному лічильнику. Вхідну радіоактивність оцінювали, підраховуючи 10% матеріалу, що потрапляє під всмоктування.

Сегментація брижових лімфатичних вузлів

Мезентеріальні лімфатичні вузли, що дренують кишкові сегменти, анатомічно визначали, простежуючи лімфатичні судини, що з’єднують товсту кишку, клубову кишку і тонку кишку з їх лімфатичними вузлами. Дуоденальні лімфатичні вузли були виявлені шляхом видалення 100 мкл оливкової олії (Sigma) та визначення найбільш проксимальних лімфатичних вузлів шлунка, оточених хілером, що свідчить про дренаж дванадцятипалої кишки, через 1 годину після забору.

Виділення лімфоцитів та АРС з лімфатичних вузлів

Тканини розсікали на холодний HBSS, додавали Mg 2+ і Ca 2+, дрібно подрібнювали та інкубували в 400 U/мл колагенази D (Roche) в HBSS протягом 25 хв при 37 ° C, 5% CO2. Колагеназу гасили на льоду додаванням остаточних 10% FCS. Одноклітинні суспензії витягували із сполучної тканини шляхом прийому та ресуспендування дайджестів п’ять разів. Еритроцити лізували інкубацією в буфері лізису еритроцитів (Sigma) протягом 7 хв при RT.

Виділення лімфоцитів та APC з тонкої та товстої кишок

Виділення клітин для РНК-послідовності

Клітини сортували за допомогою проточного цитометра FACS Aria для сортування клітин (Becton Dickinson). Дендритні клітини MLN попередньо збагачували за допомогою набору для ізоляції пандеритних клітин (130-100-875, Miltenyi Biotec) та колонок розділення LS MACS (Miltenyi Biotec). 14-тижневі чоловіки C57BL/6 служили донорами mLN, і були зібрані біологічні тричі або чотириразові повтори. Дендритні клітини сортували як Aqua - CD45 + Lin - (CD3 - B220 - NK1.1 - CD19 -) CD11c hi, а субпопуляції далі як MHCII hi CD103 + CD11b - та MHCII hi CD103 + CD11b +. Триста клітин сортували безпосередньо в 25 мкл буфера TCL (Qiagen, 1031576), доповненого 1% β-меркаптоетанолом з точністю до однієї клітини. Зразки витримували при кімнатній температурі протягом 5 хв, віджимали і витримували при - 80 °З до подальшої обробки.