Відносний внесок NMDAR у збудливі постсинаптичні струми контролюється за допомогою Са2
Фліза Валіулліна
1 OpenLab з нейробіології, Казанський федеральний університет, Казань, Росія
Юлія Захарова
1 OpenLab з нейробіології, Казанський федеральний університет, Казань, Росія
Марат Мухтаров
1 OpenLab з нейробіології, Казанський федеральний університет, Казань, Росія
Андреас Драгун
2 Кафедра фізіології та патофізіології, Університет Гейдельберга, Гейдельберг, Німеччина
Цвях Бурнашев
3 INMED, Інститут нейробіології медичного університету UMR901, Екс-Марсельський університет, Марсель, Франція
4 INSERM U901, Марсель, Франція
Андрій Розов
1 OpenLab з нейробіології, Казанський федеральний університет, Казань, Росія
2 Кафедра фізіології та патофізіології, Університет Гейдельберга, Гейдельберг, Німеччина
Анотація
Вступ
Ми повідомляємо, що маніпулювання буферною ємністю Ca 2+ пірамідних нейронів CA1 гіпокампа сильно впливає на амплітуду одиничних, допорогових EPSM, опосередкованих NMDAR. Більше того, при високочастотній аферентній стимуляції одночасне полегшення блокування Mg 2+ та CIIN збільшило внесок NMDAR у постсинаптичні EPSP та значно продовжило час їх розпаду. Отримані нами дані свідчать про те, що потік Са 2+, індукований під час унітарних синаптичних подій, є достатнім для того, щоб спричинити гальмування NMDAR. Повторна активація збудливих синапсів призводить до значного подовження вікна інтеграції для синаптично викликаних потенціалів дії (AP).
Матеріали і методи
Всі експериментальні протоколи виконувались згідно з положеннями Казанського федерального університету щодо використання лабораторних тварин (етичне схвалення Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Казанського державного медичного університету N9–2013) або урядом штату Баден-Вюртемберг, Німеччина . Всі зусилля були докладені для мінімізації страждань тварин та зменшення кількості використовуваних тварин.
Поперечні зрізи гіпокампа розміром 250 мкм готували з мозку мишей 14–21-денної давності (C57 BL/6J), убитих вивихом шийки матки. Камера для нарізання містила кисневий крижаний розчин (модифікований від Dugue et al., 2005), що складається з (у мМ): K-глюконат, 140; N- (2-гідроксиетил) піперазин-N'-етансульфокислота (HEPES), 10; Na-глюконат, 15; етиленгліколь-біс (2-аміноетил) -N, N, N ′, N′-тетраоцтова кислота (EGTA), 0,2; і NaCl, 4 (рН 7,2). Зрізи інкубували протягом 30 хв при температурі 35 ° C, перш ніж зберігати їх при кімнатній температурі (22–24 ° C) у штучній СМЖ (ACSF), що містить (у мМ): NaCl, 125; NaHCO3, 25; KCl, 2,5; NaH2PO4, 1,25; MgCl2, 1; CaCl2, 2; і глюкоза, 25; барботується з 95% O2 і 5% CO2. Без Mg 2+ ACSF мав 0 мМ MgCl2 та 0,2 мМ ЕДТА.
Патч-електроди витягували з твердого боросилікатного капілярного скла (полум'яний/коричневий знімач мікропіпетки Sutter Instruments). В експериментах, проведених в режимі затиску напруги, внутрішньоклітинний розчин складався (в мМ): Cs-глюконат, 100; CsCl, 40; ХЕПЕС, 10; NaCl, 8; MgATP, 4; MgGTP, 0,3; фосфокреатин, 10 (рН 7,3 з CsOH). У експериментах зі струмовим затискачем Cs + замінювали K + у розчині піпетки.
Під час записів проводився моніторинг мембранної резистентності, а дані клітин, у яких мембранна резистентність варіювалась> 15%, були виключені з аналізу. У статті n посилається на кількість експериментів у групі.
Для статистичного аналізу був використаний тест Манна-Уітні, і дані представлені як середнє значення ± SD, якщо не вказано інше.
Результати
Входу Ca 2+ під час унітарних допорогових синаптичних відповідей достатньо, щоб викликати CIIN
Вплив буферів Ca 2+ на амплітуду опосередкованого NMDAR EPSC у позаклітинному розчині без Mg 2+. (A) Усереднені виділені сполуки EPSC (синій), aEPSC (червоний), nEPSC (чорний) при -70 мВ та nEPSC (зелений) при 50 мВ, записані безкліфними та містять EGTA внутрішньоклітинними розчинами. Гістограми стовпчиків порівнюють вплив буферного навантаження на співвідношення амплітуд aEPSC, виміряних при -70 мВ, до nEPSC, виміряних при -70 мВ (ліворуч) та 50 мВ (праворуч). (B) Середні поїзди опосередкованих NMDAR EPSC, зафіксованих з розчинами, що не містять EGTA та EGTA. Гістограми стовпчиків показують вплив навантаження EGTA на співвідношення амплітуд (PPR) другого (лівого) та п'ятого (правого) nEPSC до амплітуди першого відгуку. Зірочки вказують на значну різницю.
Щоб перевірити, чи можна збільшити ступінь CIIN за допомогою тривалої підпорогової синаптичної стимуляції, ми виміряли та порівняли співвідношення амплітуд другого (NMDA2) та п'ятого (NMDA5) nEPSC до першого nEPSC (NMDA1), використовуючи протокол стимуляції з п'ятьма імпульсами (10 Гц) у нейронах, завантажених внутрішньоклітинними розчинами, що не містять буфер, або містять EGTA (Рисунок (Рисунок 1B). 1B). Середнє співвідношення NMDA2/NMDA1 було незначно збільшено, але не суттєво, за допомогою буферного завантаження (без EGTA: 1,23 ± 0,11, n = 6; EGTA, що містить: 1,36 ± 0,21, n = 5; p = 0,662). Пізніші відповіді, однак, були чітко посилені буферизацією Ca 2+: співвідношення NMDA5/NMDA1 становило 0,9 ± 0,15 у нейронах, заклеєних розчином без EGTA (n = 6), і 1,28 ± 0,21 у нейронах, що містять EGTA (n = 5; р = 0,009). Ці дані вказують на те, що CIIN дійсно змінює внесок NMDAR в унітарні реакції, маючи сильніший вплив на опосередковані NMDAR струми під час тривалої повторюваної активності.
У присутності Mg 2+ CIIN впливає на опосередковані NMDAR струми незалежним від напруги способом
CIIN сильно зменшує амплітуди nEPSC при негативних потенціалах, але не змінює залежність напруги блоку Mg 2+. (A) Нормалізовані (50 мВ) синаптично викликані NMDAR-опосередковані відповіді, зафіксовані при -70, -35, 0, 35 і 50 мВ від пірамідних клітин CA1, діалізованих внутрішньоклітинними розчинами, що не містять буфер, EGTA або BAPTA. (B, C) Співвідношення напруги струму nEPSC нормуються до амплітуд при 50 мВ (B) і -70 мВ (C) отримані з безбуферними (червоний), EGTA- (чорний) та BAPTA-містять (зелений) внутрішньоклітинними розчинами.
Відносний внесок NMDAR у постсинаптичні відповіді суворо контролюється CIIN
Для подальшого обґрунтування модулюючої ролі CIIN у фізіологічних умовах та оцінки його впливу на амплітуду сполучених EPSC ми порівняли реакції, опосередковані AMPAR- та NMDAR, виміряні при -70 та -35 мВ у нейронах, заклеєних безбуферною та буферсодержащей піпеткою рішення. При обох потенціалах утримання відносні амплітуди nEPSC, зареєстровані з клітин, діалізованих безклітинним внутрішньоклітинним розчином, були значно меншими в порівнянні з вимірюваними з EGTA (10 мМ) або BAPTA (1 мМ), як вказують набагато менші співвідношення AMPA/NMDA (Рисунки 3A, B).
Вплив CIIN на внесок NMDAR у складні EPSC. (A) Реакції, опосередковані AMPAR- (червоний) та NMDAR- (чорний), зафіксовані при -70 та -35 мВ від нейронів з розчином піпетки, що не містить буфера або містить буфер. (B) Гістограми барів порівнюють вплив навантаження EGTA або BAPTA на співвідношення AMPA/NMDA, отримані при -70 (ліворуч) та -35 мВ (праворуч). (C) Зважені IV внутрішньоклітинних синаптичних aEPSC (кола) та nEPSC (трикутники), виміряні з нейронів, діалізованих безбуферними (червоний), EGTA- (чорний) або BAPTA-містять (синій) внутрішньоклітинними розчинами. (D) Залежність напруги відносного внеску NMDAR до синаптичного EPSC за наявності або відсутності буферів Ca 2+. Позначення те саме, що і на (C). Зірочки вказують на значну різницю.