Використання вірусу Коксакі В3 як моделі гострого панкреатиту Панкреапедія

Закладка/Пошук у цій публікації

Джонатан Х. Холл (1) і Ден Л. Клеменс (1,2)

Тип методів:

Вступна версія:

Цитування:

Розмір вкладення
Використання вірусу Coxsacklevirus B3 як моделі гострого панкреатиту.pdf 497,11 КБ

1. Вступ

Гострий панкреатит - серйозне гастроентерологічне захворювання, що характеризується запаленням та ураженням екзокринної підшлункової залози. Як правило, це самообмеження, але приблизно в 20% випадків розвиваються важкі клінічні ускладнення, що призводять до тяжкого гострого панкреатиту із наслідком смертності до 30% (25, 39, 40). Важкий гострий панкреатит пов’язаний із системним запаленням, поліорганною недостатністю та високою смертністю. На жаль, в даний час не існує специфічної фармакотерапії для лікування або запобігання прогресуванню цього захворювання.

Найбільш поширеними етіологічними факторами, пов'язаними з гострим панкреатитом у дорослих, є камені в жовчному міхурі та зловживання алкоголем, хоча в 20-30% випадків причина невідома (6). На відміну від загальних етіологічних факторів у дітей є наркотики, інфекції, травми та анатомічні відхилення (32). Цікаво, що в огляді літератури Беніфла та Вейцман повідомили, що приблизно 10% педіатричних випадків гострого панкреатиту були наслідком вірусних інфекцій (3).

2. Матеріали та реактиви

2.1 Матеріали

  1. Агароза
  2. Порошковий модифікований орел Дульбекко
  3. Фетальна бичача сироватка
  4. Ротор і трубки Bechman SW 28 або SW 41
  5. Формальдегід
  6. Кришталева фіалка
  7. Скляні гомогенізатори (шліфувальні машини Dounce Tissue Grinders)
  8. 12 планшетів для культури тканин із лунками

2.2 Реактиви

a. Приготування 0,5% агарози/DMEM

0,5% розчин агарози/DMEM виготовляють шляхом приготування 2 окремих розчинів: 1% розчину агарози та 2X DMEM. 1% розчин агарози готують додаванням 1 г агарози/100 мл дистильованої води і стерилізують автоклавуванням. Потім розчин агарози охолоджують на водяній бані до 55 o C. Два рази розчину DMEM готують шляхом додавання подвійної рекомендованої ваги порошкоподібного DMEM та бікарбонату натрію до об’єму, який ви хочете підготувати (зазвичай 100 мл). РН доводять до 7,2, фільтрують через 0,22 мкм фільтр і нагрівають до 55 o C. 0,5% розчин агарози/DMEM готують, поєднуючи рівні обсяги розчинів агарози та 2X DMEM безпосередньо перед використанням для накладання. клітини.

b. Приготування 20% формаліну

Формалін - це основний розчин 37% формальдегіду. Для приготування 20% формаліну вихідний розчин формаліну розводять 1: 5 дистильованою водою, отримуючи 7,4% формальдегіду

c. Приготування 1% кришталево-фіолетового

Кришталеву фіалку готують додаванням 5 г кристалічно-фіолетової до 395 мл H2O і 105 мл 20% етанолу. Потім розчин фільтрують через 0,22 мкм фільтр.

3. Методи

Віруси CVB3 є патогенами людини (26, 34). Через це при роботі з CVB3 слід застосовувати запобіжні заходи щодо BSL2. Вся робота з цими вірусами повинна виконуватися в затвердженому кабінеті біобезпеки типу II, а будь-яке потенційно забруднене обладнання або тверді відходи повинні бути знезаражені 10% розчином відбілювача або автоклавуванням. Після роботи з тканинами або розчинами, які можуть бути забруднені CVB3, всі поверхні необхідно очистити 10% розчином відбілювача.

Штами CVB3, які ми використовуємо, є патогенами людини, які були виділені від осіб, які перенесли інфекції CVB3. Ці віруси не пристосовані до мишей, але викликають у мишей захворювання, подібні до тих, що спостерігаються у людей (34). Через це ми культивуємо вірус у клітинних лініях людського походження, як правило, клітинах HeLa.

a. Зростання та ізоляція вірусів

b. Титрування вірусу методом аналізу нальоту

Ми використовуємо клітини HeLa для росту та титрування CVB3.