Вимірювання впливу західної дієти на архітектуру тканин печінки методом автофлюоресценції FLIM та

Суман Ранджит

1 Лабораторія динаміки флуоресценції, кафедра біомедичної інженерії, Каліфорнійський університет, Ірвін, Каліфорнія, США

Олександр Дворников

Євгенія Добринських

2 кафедри медицини, Медичний університет Колорадо-Аншутц, Аврора, Колорадо, США

Сяосін Ван

2 кафедри медицини, Медичний університет Колорадо-Аншутц, Аврора, Колорадо, США

Юхуань Ло

2 кафедри медицини, Медичний університет Колорадо-Аншутц, Аврора, Колорадо, США

Моше Леві

2 кафедри медицини, Медичний університет Колорадо-Аншутц, Аврора, Колорадо, США

Енріко ratреттон

Анотація

Фазовий підхід до візуалізації автофлуоресценції протягом життя був використаний для ідентифікації та характеристики видів, що тривалий термін життя (LLS) (

7,8 нс) у печінці мишей, яких годували західною дієтою. Розмір територій, що містять цей вид LLS, залежить від типу дієти, і розподіл за розмірами показує, що західна дієта має набагато більші розміри LLS. Поєднання зображень третьої гармоніки із FLIM ідентифікувало види LLS із краплями жиру та було оцінено розподіл розміру крапель. Мікроскопія другої гармоніки у поєднанні з фазором FLIM показує, що при західній дієті спостерігається збільшення фіброзу. Нове розкладання трьох компонентів фазового сюжету показує, що західна дієта корелює з більшою часткою вільного NADH, що означає більший стан зниження та більший гліколітичний стан. Багатопараметричний аналіз розподілу фазорів показує, що від розподілу фазорних точок можна відокремити західну дієту, яку годують, та дієту з низьким вмістом жиру, яку годують зразками печінки мишей. Фазовий підхід до аналізу FLIM-зображень автофлуоресценції у зразках печінки може призвести до відкриття нових флуоресцентних видів, і тоді ці нові флуоресцентні види можуть допомогти оцінити архітектуру тканин. Нарешті, інтеграція FLIM та аналіз другої та третьої гармонік забезпечує міру прогресування фіброзу як ефекту дієти.

1. Вступ

7,8 нс), знайдений у крапельках жиру в тканинах печінки, що є результатом західної дієти. Раніше цей вид тривалого життя спостерігався в клітинах, що харчуються олеїновою кислотою, або коли клітини перебувають у гіпоксії для утворення активних форм кисню (АФК) або в жирових тканинах миші [22, 23]. Раман-сигнатура тригліцеридів збігається з наявністю цього виду LLS у цих краплях при обробці олеїновою кислотою [22]. Окислення АФК жирових молекул є ймовірною причиною утворення LLS, і тут ми використали цей сигнал LLS для виявлення та розрізнення впливу західної дієти на зрізи тканин печінки.

Мікроскоп, що використовується для наших вимірювань, базується на детекторі прямого напрямку, де дані збираються у напрямку збудження, і він чудово чутливий для гармонічного зображення [24-26]. У роботі, описаній у цій роботі, ми використовували зображення генерації третьої гармоніки, особливо чутливі до меж крапель жиру, щоб показати, що компонент LLS збігається з краплями [27]. Ми також використовували комбінаторний підхід FLIM та генерації другої гармоніки (SHG) для кількісної оцінки ступеня фіброзу в тканинах печінки [28–32].

2. Методи

2.1 Модель тварини та підготовка зрізу тканини

8-тижневих мишей-самців C57BL/6J отримували з лабораторії Jackson. Їм годували 6 місяців відповідну контрольну дієту з низьким вмістом жиру (НЖ, 10 ккал% жиру) або західну дієту (ВД, 42 ккал% молочного жиру, 34% сахарози, 0,2% холестерину). Дослідження на тваринах та відносні протоколи були затверджені Комітетом з догляду та використання тварин при Університеті Колорадо в Денвері. Усі експерименти на тваринах проводились відповідно до Керівництва з догляду та використання лабораторних тварин (Національний інститут охорони здоров’я, Бетесда, штат Медіка).

В кінці періоду годування мишей знеболювали, а печінку видаляли та обробляли замороженою в суміші OCT (оптимальна температура різання) або фіксованому формаліні та вкладеному парафіні (FFPE). Тканину розрізали на ділянки товщиною 5 мкм, і цю ділянку встановили на предметне скло. З'єднання OCT видаляли за допомогою буфера DPBS (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) і зріз встановлювали на покривному склі, використовуючи той самий буфер. Зрізи парафіну візуалізували з оптичним зрізом після “підкладки” предметних стекол при 60 ° C без подальшого видалення парафіну ксилолом та етанолом.

2.2 Збір даних: DIVER та фазовий підхід до FLIM

2.3 Аналіз даних

2.3.1 Фазовий аналіз

Флуоресценція та гармонічні сигнали, зібрані з кожної точки зображення, перетворювались у простір фазорів за допомогою наступного перетворення [20, 33, 34]

де si, j (ω) та gi, j (ω) - координати Y та X у фазовому графіку відповідно; ω - частота повторення джерела лазера в радіанах, T - період частоти повторення лазера і n - частота гармонік. Ii, j - затухання інтенсивності, виміряне на кожному пікселі вихідного оптичного зображення. Флуоресценція, зібрана з кожного пікселя зображення, перетворюється в точку на фазовому графіку. Зміни метаболізму та накопичення ліпідів внаслідок змін у раціоні можуть змінити положення фазових точок та загальну схему розподілу фазової ділянки. Потім можна вибрати набір фазових точок, використовуючи кольоровий курсор, і відповідне зображення можна відповідно забарвити. Ми описуємо різні способи аналізу розподілу фазорів для кількісної оцінки різних видів у спостережуваній тканині.

2.3.2 Розрахунок розміру крапель ліпідів

Місце розташування видів, що живуть довгий час, на фазовій ділянці було обрано червоним курсором, а зображення FLIM були відповідно пофарбовані (рис. 1 (d)). Вид LLS присутній лише в краплях ліпідів. Таким чином, розмір крапель можна виміряти, вимірявши розмір площі зображень, охоплених LLS. Існує велика кількість крапель дуже малого розміру, які зазвичай присутні в тканинах печінки. Порогове значення> 85 мкм 2 у розподілі за розміром для крапель жиру призводить до кращого відокремлення зображень від тканин печінки при західній дієті з високим вмістом жиру та дієті з низьким вмістом жиру. Тоді розміри крапель можуть бути представлені графіком коробки або гістограмами (рис. 1 (e) та 1 (f). Графік поля показує, як змінюється середнє та стандартне відхилення розміру крапель залежно від типу Гістограма показує, як краплі для західної дієти поширюються на значно більші розміри, ніж ті, що спостерігаються для зразків дієти з низьким вмістом жиру.