Виробництво молочної кислоти L () з використанням грибу Rhizopus oryzae із закріпленим полі (вініловим спиртом) криогелем

Кафедра хімічної ензимології хімічного факультету ім. Московський державний університет імені Ломоносова, пагорби Леніна, 1/11, 119992, Москва, Росія

Кафедра хімічної ензимології хімічного факультету ім. Московський державний університет імені Ломоносова, пагорби Леніна, 1/11, 119992, Москва, Росія === Шукати інші статті цього автора

А.Н. Інститут елементоорганічних сполук ім. Несмеянова РАН, вул. Вавілова, 28, 119991 Москва, Росія

Кафедра хімічної ензимології хімічного факультету ім. Московський державний університет імені Ломоносова, пагорби Леніна, 1/11, 119992 Москва, Росія

А.Н. Інститут елементоорганічних сполук ім. Несмеянова РАН, вул. Вавілова, 28, 119991 Москва, Росія

Представлено частково на засіданні COST з питань біокапсуляції (Белград, червень 2004 р.)

Анотація

ВСТУП

У наш час виробництво молочної кислоти (ЛК), яка широко використовується в різних областях, продовжує зростати. 1 У цьому відношенні особливий інтерес представляють нові біотехнологічні підходи до інтенсифікації виробництва LA, а також пошук нових мікробних виробників. Для ферментації LA використовувались різні штами бактерій2, але всі вони потребують багатих поживних середовищ зі значеннями рН не менше 5,5. За цих умов відбувається ріст клітин; тому велика частина поживних речовин витрачається для накопичення клітинної біомаси, а не для синтезу продукту. Таким чином, кінцева концентрація цільового продукту (а саме LA) нижча, ніж можна отримати за відсутності росту клітин. З іншого боку, використання грибів замість бактерій як виробників LA є дуже привабливим, 3 оскільки гриби стійкі до високих концентрацій накопиченого LA. 4, 5 Крім того, на відміну від бактерій, які продукують рацемічні суміші D (-) та L (+) - форм LA, гриби дозволяють продукувати практично чистий L (+) - LA.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Використовуваний у роботі картопляний крохмаль (вищий сорт) та ПВА (торгова марка 16/1) були придбані у Білиницького крохмального заводу (м. Белінічі, Білорусь) та НПО «Азот» (Сєвєродонецьк, Україна) відповідно. Грибний штам Rhizopus oryzae NRRL ‐ 395 отримано від Російської національної колекції промислових мікроорганізмів. Спори вирощували на картопляно-декстрозному середовищі 6 з агаром (2%).

Намистини ІВС діаметром 1–1,5 мм були приготовані шляхом захоплення R. oryzae спори у PVA-CG з подальшим проростанням клітин відповідно до запатентованої процедури. 11

Середовище з глюкозою, яке використовували для ферментації LA, було таким (г L -1): глюкоза - до 120, (NH4) 2SO4 - 3,0, MgSO4,7H2O - 0,3, ZnSO4,7H2O - 0,05, KH2PO4 - 0,2.

Для приготування середовища на основі кислотного гідролізату крохмалю останній зріджували за допомогою кислотного гідролізу при 121 ° С протягом 1 год з подальшою нейтралізацією гідроксидом натрію. Необхідна кількість 2 моль L -1 HCl становила 0,5% (об/об). Отриманий таким чином гідролізат аналізували на концентрацію глюкози і збагачували його такими солями (г L -1): (NH4) 2SO4 - 3,02, MgSO4,7H2O - 0,25, ZnSO4,7H2O - 0,04, KH2PO4 - 0,15.

Для проведення ферментації LA, використовуючи нативний крохмаль як основний субстрат, картопляний крохмаль желатинизували при 70 ° C протягом 5 хв. Ті ж солі, що використовувались в експериментах з гідролізатами крохмалю, додавали для приготування ферментаційного середовища.

Культивування іммобілізованих клітин проводили на шейкері при 200 об/хв, 28 ° C та рН 5,0–6,0. Намистини IBC використовувались у періодичних та напівзавантажених процесах; IBC промивали 20 ммоль L-1 K/Na-фосфатного буфера (pH 6,8) після кожного періоду циклу. Для підтримання рН на оптимальному рівні до ферментаційного середовища перед вирощуванням додавали карбонат кальцію (5–10 г L -1), попередньо стерилізований у сухому вигляді.

Концентрацію іммобілізованих клітин розраховували згідно з відомою процедурою. 4

Продуктивність процесу визначали як кількість розчинної та осадженої LA, яка накопичувалась у відварі протягом усього процесу. Перед аналізом осад лактату кальцію перетворювали у розчинну форму шляхом додавання сірчаної кислоти. Загальну концентрацію LA визначали за допомогою ВЕРХ (Econo System, Bio-Rad), використовуючи колонку для виведення іонів Aminex HPX ‐ 87H. Елюент, 2 ммоль L -1 бензойної кислоти, використовували при швидкості потоку 0,7 мл хв -1, а температура колонки становила 80 ° C. Концентрацію крохмалю аналізували йодним колориметричним методом. Концентрації ізомеру L (+) - LA та глюкози визначали ферментативними методами з використанням набору L (+) - лактат-оксидаза-пероксидаза (Sentinel, Італія) та набору глюкозо-оксидаза-пероксидаза (Impact, Росія) відповідно.

РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ

Приготування іммобілізованого біокаталізатора

Процедура приготування IBC на основі клітин грибка, захоплених у кріогель PVA, складалася з двох основних етапів: (i) захоплення R. oryzae спори в матриксі кріогелю та (ii) рослинність клітин грибка всередині гелевих кульки до стійкого стану. PVA-CG був обраний носієм іммобілізації, оскільки ця матриця, незважаючи на свою високу пористість (що забезпечує безперешкодну дифузію субстратів та метаболітів будь-якої молекулярної маси), має дуже хороші механічні властивості та низьку чутливість до абразивної ерозії навіть у реактори з дуже інтенсивним перемішуванням. 8-10 Розмір макропор (поперечний переріз приблизно 1-2 мкм) та їх взаємопов'язана архітектура дають достатньо місця для росту гелезахищеного міцелію на другій стадії (ii) утворення IBC. Це добре видно на рис. 1, на якому показано SEM-зображення внутрішньої області бісеру IBC. Цей показник також підтверджує, що під час росту клітин відсутні обмеження щодо поживних речовин та кисню для цього іммобілізованого аеробного штаму, оскільки утворився добре розвинений міцелій.