Високий протонічний потенціал спрацьовує у механізмі утворення активних форм кисню в Росії

Кафедра біоенергетики ім. Білозерський інститут фізико-хімічної біології Московського державного університету, Москва 119899, Росія

Відповідний автор. Факс: (7) (95) 939 03 38 або (7) (95) 939 31 81. Електронна пошта: [email protected] Шукати інші статті цього автора

Анотація

Утворення H2O2 вивчали в мітохондріях серця щурів, попередньо оброблених H2O2 та амінотріазолом, щоб знизити їх антиоксидантну здатність. Показано, що швидкість утворення H2O2 в мітохондріях, окислюючи 6 мМ сукцинату, інгібується протонофорним роз'єднувачем, АДФ і фосфатом, малонатом, ротеноном і міксотіазолом, і стимулюється антиміцином А. Ефект АДФ скасовується за допомогою карбоксиатрактилату та олігоміцину. Додавання розпарювача після ротенону індукує подальше пригнічення вироблення H2O2. Показано, що інгібування утворення H2O2 відпарювачем, малонатом та ADP + Pi пропорційне зменшенню ΔΨ цими сполуками. Виявлено порогове значення ΨΨ, вище якого відбувається дуже сильне збільшення виробництва H2O2. Цей поріг трохи перевищує рівень 3 ΔΨ. Отримані дані відповідають концепції [Скулачов В.П., Q. Rev. Biophys. 29 (1996), 169–202], що висока рушійна сила протону в стані 4 потенційно небезпечна для клітини через збільшення ймовірності утворення супероксиду.

1. Вступ

У 1973 р. Boveris and Chance [1] встановили, що роз'єднувач окисного фосфорилювання (CCCP) або ADP + Pi інгібує утворення H2O2 мітохондріями, окислюючи сукцинат та глутамат. Пізніше Лю та Хуан [2, 3] повідомили про дуже круту залежність продукування O −⋅ 2 та H2O2 мітохондріями від рівня ΔΨ на мембрані мітохондрій. В їх експерименті ΔΨ зменшували, додаючи різні концентрації малонату, що зменшує частоту дихання стану 4. Тому можна припустити, що утворення активних форм кисню (АФК) є функцією транспорту електронів дихального ланцюга, а не ΔΨ.

Наша група запропонувала [4-6], що активація вироблення АФК у стані 4, коли протонний потенціал високий, а частота дихання обмежена відсутністю АДФ, пов'язана з тим, що деякі перехідні процеси транспорту електронів дихального ланцюга здатні зменшувати Від O2 до O −⋅ 2, такі як CoQH ⋅, стають довгожителями. Передбачалося, що мітохондрії оснащені спеціальним механізмом (`` м'яке розчеплення ''), що запобігає занадто високому протонному потенціалу.

У цій роботі ми повторно досліджуємо проблему мітохондріальних АФК-протонних потенційних зв'язків. Було виявлено, що будь-яке зниження стану 4 ΔΨ призводило до сильного пригнічення утворення H2O2 мітохондріями незалежно від того, додавали активатори (розпарювач або ADP + Pi) або інгібітори (малонат) транспорту електронів, щоб спричинити зниження ΔΨ. Виявлено порогове значення ΨΨ, необхідне для підвищення рівня генерації H2O2.

2 Матеріали та методи

Мітохондрії були виділені із серцевого м’яза щурів. Охолоджені м'язи, очищені від жиру і сухожиль, подрібнювали і пропускали через прес з нержавіючої сталі з отворами діаметром близько 1 мм. Потім тканину гомогенізували протягом 3 хв тефлоновим маточкою у скляному (Pyrex) гомогенізаторі, співвідношення тканина: ізоляційна суміш становило 1: 8. Після першого центрифугування (10 хв, 700 ×g), супернатант декантирували і фільтрували через марлю, потім центрифугували (10 хв, 16000 ×g). Осад суспендували в 1 мл ізолюючої суміші (250 мМ сахарози, 10 мМ MOPS, 1 мМ EDTA, рН 7,4) з додаванням BSA (3 мг/мл). Потім суміш ще раз центрифугували і промивали ізолюючим середовищем без BSA (10 хв, 16000 ×g). Остаточний мітохондріальний осад суспендували в ізолюючій суміші (70–90 мг білка/мл) і зберігали на льоду.

У всіх експериментах, показаних на малюнках, вищевказану процедуру доповнювали обробкою мітохондрій 2 мМ H2O2 та 7 мМ амінотріазолом, які додавали до супернатанту перед другим центрифугуванням.

Споживання кисню реєстрували за допомогою кисневого електрода типу Кларка та полярографа Rank Brothers.

Рівень ΔΨ оцінювали за допомогою сафраніну О. Співвідношення барвника (нмоль) до білка мітохондрій (мг) становило 20: 1. Слід зазначити, що було показано, що реакція сафраніну O лінійно залежить від ΔΨ в області 50–170 мВ [7-9] .