Вміст альфа-ліноленової кислоти в насінні льону пов’язано з індукцією жирового лептину
Анотація
Вступ
Адипоцити, клітини, що складають основну масу жирової тканини в організмі, відіграють важливу фізіологічну роль поза здатністю зберігання ліпідів. Вони секретують ряд важливих клітинних сигнальних молекул, які називаються адипокінами. Ці адипокіни мають наслідки, починаючи від місцевих аутокринних та паракринних ефектів і закінчуючи системними ендокринними діями. Адипокіни також сильно відрізняються як за своєю функцією, так і за механізмами контролю. Одним з таких механізмів контролю є жирнокислотний склад жирової тканини, який може впливати на клітинну сигналізацію, торгівлю жирними кислотами, експресію генів і, отже, метаболізм [1]. Склад жирової тканини варіюється залежно від двох основних ефекторів: енергетичного балансу, який регулює метаболізм вільних жирних кислот у жировій тканині, та дієти, яка змінить профіль жирних кислот жирової тканини. Незважаючи на те, що перший досліджували широко, особливо щодо експресії лептину та диференціації адипоцитів, вплив останнього на ендокринну функцію почали досліджувати лише нещодавно.
Адипонектин - це найбільш виражений і секретується адипокін, сприятливо впливає на обмін речовин, запалення та роботу судин. Адипонектин має парадоксальний характер вираження. Зі збільшенням ожиріння експресія і секреція адипонектину зменшується в жировій тканині [2]. Вважається, що цей парадокс є частиною патології ожиріння і є симптомом дисфункціональної жирової тканини. Адіпонектин відіграє роль у чутливості до інсуліну, окисленні ЛПНЩ, активації eNOS, придушенні запалення та катаболізмі жирних кислот [3–5]. Таким чином, гіпоадіпонектинемія представляє інтерес як біомаркер як серцево-судинних захворювань, так і метаболічного синдрому.
Ще одним важливим адипокіном, який може стимулюватися зміною профілю жирних кислот, є лептин. Вперше це було виявлено як білок, кодований ожиріння ген, названий за фенотип подвійної нокаутованої миші. Ці миші не відчувають ситості, і, отже, їдять безперервно, коли їх годують довільно, що призводить до важкого ожиріння, спричиненого дієтою. У людей дефіцит лептину спричинений у випадках патологічного ожиріння як генетичний фактор, або метаболічна недостатність [6, 7]. Роль лептина в опосередкованому гіпоталамом придушенні апетиту у відповідь на споживання калорій не є єдиною його функцією. Лептин також може мати важливе значення в модуляції активності Т-клітин на ранніх стадіях атеросклеротичного розвитку, а також інших імунних клітин [8]. При ожирінні лептин може бути недостатньо виражений жировою тканиною у відповідь на стабільно висококалорійну дієту, або рецептори лептину можуть бути знижені, що призводить до високого рівня лептину в плазмі крові та стійкості до лептину [9].
Насіння льону останнім часом набуває популярності як функціональний корм. Альфа-ліноленова кислота (ALA) становить приблизно 55% загального вмісту жирних кислот у жирних кислотах льону [10]. Багаті на ALA дієти, включаючи дієти, збагачені меленим лляним насінням, показали в інтервенційних та експериментальних випробуваннях зменшення як летального, так і нефатального інфаркту міокарда [11, 12], серцевих аритмій [12–15] та частоти атеросклеротичних уражень [12, 14, 16, 17]. Однак механізм, за допомогою якого ALA та насіння льону індукують цю серцево-захисну дію, незрозумілий. Попередні дані вказували на те, що ALA із збагаченої насінням льону дієти відкладається в жировій тканині [18]. Тому цілком можливо, що ця зміна вмісту жирних кислот у жировій тканині може впливати на функцію жирової тканини. Ми припускаємо, що зміна складу ліпідів у жировій тканині у відповідь на дієту з добавкою льону може вплинути на передачу адипокіну від адипоцитів. Отже, можливо, корисні серцево-судинні дії насіння льону, які спостерігались раніше, можуть бути пов'язані зі змінами експресії адипокіну.
Матеріали і методи
Дієта та годування
Всі експерименти проводились відповідно до рекомендацій Канадської ради з догляду за тваринами. Шістнадцять чоловічих новозеландських білих кроликів (2,8 ± 0,1 кг, Південна троянда кроликів) були випадковим чином призначені для отримання однієї з чотирьох дієт. Дієти готувались, як було описано раніше [15, 17], шляхом додавання компонентів до звичайної (RG) кролячої дієти (повний раціон кроликів CO-OP, Федеративні кооперативи): 0,5% холестерину (CH) або 10% меленого льону (FX), або обидва (CF) протягом 8 тижнів ( = 4). Чау зберігали при 4 ° C і захищали від світла. Дієти відрізнялися лише загальним вмістом жиру завдяки включенню в ньому багатого на природу ALA меленого насіння льону (таблиці 1, 2). Склад дієтичних жирних кислот викладений у таблиці 2. Додавання лляного насіння до раціону значно збільшило кількість C16: 0, C18: 0, C18: 1 (олеїнова кислота) та C18: 3 (ALA). Додавання холестерину не мало значного впливу на дієтичні жирні кислоти, порівняно з дієтою РГ. Кроликів годували 125 г/день раціону.
Забір крові та аналіз
Кров брали з лівої крайової вушної вени кроликів, які голодували протягом ночі перед початком експериментальної дієти та через 8 тижнів. Її збирали у вакуаторні пробірки, що містять ЕДТА (Бектон – Дікінсон). Зразки крові центрифугували при 4500 ×g при кімнатній температурі протягом 10 хв, а потім плазму зберігали при -80 ° C. Перед аналізом зразки плазми розморожували та центрифугували при 6800 ×g. Рівні холестерину та тригліцеридів у плазмі крові аналізували за допомогою аналізатора крові VetTest 8008 (лабораторії IDEXX). Жирні кислоти витягували з плазми та дериватизували, як описано раніше [15, 18].
Колекція тканин
Після 8 тижнів дієтичного лікування тварини були евтаназовані 5% -ним ізофлураном, що надходить під маску для обличчя, з подальшою серцевою екстракцією. Забирали ретроперитонеальну та епідидимальну жирові тканини. Щоб запобігти забрудненню RNase, тварину та інструменти обприскували RNaseZap (Ambion) як до, так і під час забору тканин. Жирову тканину негайно поміщали в RNAlater і витримували протягом ночі при 4 ° C, як зазначено в інструкціях виробника (Ambion). Попереднє тестування показало, що була успішна стабілізація мРНК порівняно із швидким заморожуванням або підтримкою протягом ночі при 4 ° С (як оцінювали за допомогою електрофорезу в агарозному гелі та подальшої qRT-ПЛР), незважаючи на високий вміст ліпідів у цій тканині. РНК пізніше видаляли з тканини відсмоктуванням, а потім зразки швидко заморожували у рідкому азоті та зберігали при -80 ° C.
qRT-ПЛР
РНК виділяли з жирової тканини в середовищі, що не містить РНКази. Жирову тканину гомогенізували в реактиві Trizol (Invitrogen), а жир видаляли. Фенол відокремлювали від розчину, двічі промиваючи розчин хлороформом. РНК осаджували з розчину етанолом і додавали до колонок RNeasy для подальшого очищення (Qiagen). Вилучену РНК кількісно визначали та оцінювали за допомогою спектрофотометра та електрофорезу в агарозному гелі. Потім його використовували для qRT-PCR (Quanta Biosystems), використовуючи систему виявлення ПЛР iQ5 у реальному часі (Bio-Rad). Праймери, розроблені з використанням програмного забезпечення BLAST (NCBI), були такими: Адипонектин: (вперед 5′ACCAGGACAAGAACGTGGAC3 ′, зворотний 5′TGGAGATGGAATCGTTGACA3 ′);
Лептин: (вперед 5′GTCGTCGGTTTGGACTTCATC3 ′, реверс 5′CGGAGGTTCTCCAGGTCGTTG3 ′) [19];
GAPDH: (вперед 5′GATGGTGAAGGTCGGAGTGAA3 ′, реверс 5′GGTGAAGACGCCAGTGGATT3 ′) [20].
Праймери були перевірені за допомогою програмного забезпечення BLAST від NCBI [21]. Невикористані зразки зберігали при -80 ° C. кДНК синтезували з 1 мкг РНК за допомогою qScript кДНК Supermix (Quanta) за вказівками виробника. qPCR тривав протягом 2 хв при 50 ° C, 95 ° C протягом 8,5 хв, потім 40 циклів при 95 ° C протягом 15 с і 60 ° C протягом 60 с, після чого дані були зафіксовані. Криву розплаву отримували після циклу при 95 ° C протягом 1 хв, після чого 55 ° C протягом 1 хв та 80 циклів захоплення 10-ти секунд 55 + 0,5 ° C/цикл. Результати нормалізували за допомогою експресії GAPDH та аналізували методом дельта-дельта-Ct за допомогою програмного забезпечення iCycler для виявлення в реальному часі.