Внесок мікробіоти кишечника в експериментальну протизапальну дію, опосередковану P28GST, та

Бенуа Фоліньє

Колін Пле

2 ун-т. Лілль, CNRS, Інсерм, CHU Лілль, Інститут Пастера де Лілля, U1019 — UMR 8204 — CIIL — Центр інфекції та імунітету Лілля, F-59000 Лілль, Франція; [email protected] (C.P.); [email protected] (C.D.)

Марі Тітекат

Арно Дендовен

Орельєн Паньї

Катерина Даніель

Елізабет Співак

Мюріель Поттьє

Бенджамін Бертін

Крістел Нойт

Домінік Депланк

3 ун-т. Лілль, Інсерм, CHU Лілль, CIC 1403, Центр досліджень клініки, F-59000 Лілль, Франція; [email protected]

Лоран Дюбюк

П’єр Деремо

4 Service des Maladies de L’Appareil Digestif et de la Nutrition, CHU Lille, F-59000 Lille, Франція

Монік Капрон

Енні Стандарт

Пов’язані дані

Анотація

1. Вступ

2. Матеріали та методи

2.1. Матеріали

Хімічні речовини та реактиви закуповували у компанії Sigma – Aldrich Chemical (St Quentin Fallavier, Франція), якщо не зазначено інше. Партії білка P28GST були виготовлені та очищені з рекомбінантної культури Saccharomyces cerevisiae в умовах належної виробничої практики компанією Eurogentec S.A (Seraing, Бельгія). P28GST консервували ліофілізованим у NH4HCO3 10 мМ та 6% лактози. Цей препарат був суспендований одночасно з 0,2% гідроксидом алюмінію або без нього, ад'ювант, сумісний з тваринами та людьми (Alhydrogel®, Brenntag Nordig, Frederikssund, Данія та Miltenyi Biotec, Париж, Франція).

2.2. Експерименти на тваринах та етика

Мишей BALB/c (самки віком 6 тижнів) купували у Charles Rivers (L’Arbresle, Франція) та утримували їх у приміщеннях для утримання тварин без патогенів. Експерименти на тваринах відповідали законодавству Франції (урядовий закон 87-848). Усі дослідження були схвалені місцевою комісією з розгляду етики розслідувань (Nord-Pas-de-Calais CEEA N ° 75, Лілль, Франція; посилання на протоколи 352012 та 19-2009R) та урядом Франції уряду № APAFIS # 7542-20 1608251651940 ).

2.3. Протоколи імунізації

Імунізацію проводили мишам BALB/c трьома підшкірними ін'єкціями (у спину між лопатками) P28GST при 5 мкг.кг -1 з інтервалом у 2 тижні, як описано раніше [7]. В якості альтернативи контрольні миші отримували або фізіологічний розчин (CTL), лише ад'ювант (ад’ювант), або P28GST з ад’ювантом (P28GST + ад’ювант).

2.4. Індукція оцінки коліту та запалення тринітробензолсульфокислотою (TNBS)

Модель тринітробензолсульфонової кислоти (TNBS) хімічно індукованого гострого коліту була впроваджена у 13-тижневих самок BALB/c (n = 10 мишей на групу), як описано раніше [30]. В інших місцях повідомлялося про анатомопатологічні та запальні показники, включаючи кількісну ланцюгову реакцію зворотної транскриптази-полімерази [31]. Коротко кажучи, 0,5 см середніх зразків товстої кишки гомогенізували за допомогою приладу FastPrep (MP Biomedicals, Illkirch, Франція), загальну РНК виділили за допомогою колон RNAspin (Macherey – Nagel, Hoerdt, Франція). Зворотну транскрипцію та ПЛР у режимі реального часу проводили з наборами реакцій (комплект високої ємності кДНК RT, Applied Biosystems - Fischer Scientific, Illkirch, Франція) та реагентами (Universal PCR Master Mix, Applied Biosystems - Fischer Scientific, Illkirch, Франція), відповідно до інструкцій виробника. Ланцюгові реакції полімерази (ПЛР) проводили на апараті MX3005P (Agilent Technologies, Les Ulis, Франція). Спеціальний аналіз експресії генів (TaqMan, Applied Biosystems) був використаний з комерційно розробленими та перевіреними праймерами, які перелічені в Таблиці S1 в Додаткових матеріалах. Ген ведення домашнього господарства, бета-актин, використовувався як внутрішній контроль. Дані аналізували за допомогою методу 2-ΔΔCt і виражали як збільшення у кратному значенні порівняно зі значеннями контрольної групи.

2.5. Пацієнти та зразки калу людини

Пацієнти із хворобою Крона (CD) були частиною пілотного клінічного випробування фази 2а, призначеного для оцінки безпеки P28GST, спрямованого на контроль запалення при помірному КР (ClinicalTrials.gov,> NCT02281916). Як французьке управління охорони здоров’я (Agence Nationale de Sécurité des Médicaments, ANSM), так і Етичний комітет Nord-Ouest IV схвалили пілотне дослідження (номер EudraCT 2013-000595-15), і всі суб’єкти дали інформовану згоду на участь у дослідженні. Вісім пацієнтів були включені після операції з резекції кишечника або середнього ступеня тяжкості. Зараховані пацієнти отримували три підшкірні ін'єкції (одна ін'єкція на місяць) по 100 мкг P28GST, асоційованого з Альгідрогелем®, як рекомендований ад'ювант. Для цього дослідження зразки калу до та після введення P28GST були отримані лише для 5 пацієнтів і дозволено аналіз мікробіоти. Зразки заморожували і зберігали при -80 ° C до аналізу.

2.6. Аналіз мікробіоти

Екстракція ДНК, цілеспрямований метагеномічний аналіз 16S та біоінформатичний аналіз були досягнуті згідно оптимізованих та стандартизованих методологій, розроблених Genoscreen (Лілль, Франція), і повністю детально описані в Додаткових матеріалах.

2.7. Лікування антибіотиками та трансплантація мікробіоти в калі

У деяких експериментах наївних мишей у віці (n = 20) лікували антибіотиками широкого спектру протягом 5 днів, щоб полегшити подальше відновлення трансплантації калових мікробіоти (Abx) (Рисунок S4). Склад антибіотичного коктейлю та відповідна процедура представлені в додаткових матеріалах.

Зразки калу десяти мишей-донорів (від 200 до 300 мг кожна) були асептично зібрані та об'єднані в 0,5% цистеїну 1X PBS для максимального збереження анаеробних бактерій. Стілець (100 мг мкл -1) контрольних або імунізованих донорів ресуспендували енергійною сумішшю протягом 1 хв і центрифугували при 2000 об/хв протягом 2 хв для осадження сміття. Супернатант збирали та доставляли відповідним віку мишам-реципієнтам через пероральний апарат (по 200 мкл кожного реципієнта) протягом 15 хв після виведення для запобігання змінам бактеріального складу. Мишей-реципієнтів (n = 10 у кожній групі), яких годували звичайною дієтою та питною водою, або обробляли антибіотиками, піддавали трансплантації мікробіоти три дні поспіль протягом трьох тижнів, починаючи з першого посилення імунізації P28GST (див. Також Рисунок S4).

2.8. Статистичний аналіз

Нарешті, ці спостереження відповідали транскрипційним сигнатурам у запалених товстих кишках (малюнок 2 A – H). Дійсно, TNBS-індукована регуляція генів запалення (таких як імуно-пов’язані Il-6, Il-1β та Tnf-α) та генів, пов’язаних з окислювальним стресом (таких як Nos2 та Cox2), була значно менш помітною P28GST + ад'ювантне лікування. Останнє також нормалізувало падіння гомеостатичних генів, які були знижені при колітах (таких як Pparγ та Zo1).