Внутрішня каталаза захищає вірус простого герпесу від інактивації перекисом водню
Анотація
Було показано, що вірус простого герпесу 1 (ВПГ-1) містить каталазу, фермент, здатний детоксифікувати перекис водню, перетворюючи її у воду та кисень. Дослідження з інгібітором каталази показали, що асоційована з вірусом каталаза може відігравати роль у захисті вірусу від окисної інактивації. Встановлено, що ВПГ-1 є більш чутливим до знищення перекисом водню у присутності інгібітора каталази, ніж за його відсутності. Результати свідчать про захисну роль каталази протягом часу, який HSV-1 проводить в окислювальному середовищі поза клітиною господаря.
Віруси відчувають досить різні середовища, залежно від того, чи вони розмножуються всередині клітини хазяїна або переходять від одного хоста до іншого. У клітині вірус та компоненти вірусу піддаються відновлювальному середовищу, де окислювально-відновний потенціал визначається головним чином глутатіоном (18). На відміну від них, за межами клітини вірус піддається дії кисню та токсичних продуктів, одержуваних з кисню, таких як перекис водню, супероксид та гідроксильний радикал, реактивні види, які мають потенціал для інактивації вірусу. Щоб впоратися з такими високореактивними сполуками, рослини та тварини експресують ферменти, здатні перетворювати їх у нетоксичні продукти. Прикладами таких ферментів є каталаза, пероксидази та супероксиддисмутаза (28). Тут ми описуємо результати досліджень, які демонструють наявність каталази в очищеному віріоні простого герпесу. Потім були проведені випробування, щоб визначити, чи може внутрішня каталаза захистити вірус від інактивації H2O2.
Дослідження каталази проводили з вірусом простого герпесу 1 (HSV-1), який вирощували на клітинах Vero в культурі та очищали центрифугуванням з градієнтом щільності сахарози. Коли суспензії вірусів доводили до 1% H2O2, бульбашки кисню починали швидко утворюватися, вказуючи на наявність каталази (рис. 1а, ліва трубка). Бульбашки стали очевидними візуально через кілька секунд інкубації при кімнатній температурі і продовжували формуватися і збільшуватися щонайменше 20 хв. Однак бульбашки не утворювались, якщо до суспензії вірусу до обробки H2O2 додавали інгібітор каталази азид натрію (рис. 1а, праворуч). Аналізи також були негативними, коли (i) вірус видаляли з розчину центрифугуванням перед додаванням H2O2 або (ii) капсиди HSV-1 (капсиди B) замінювали інтактним вірусом. У подібних аналізах бульбашки, що вказують на наявність каталази, не спостерігались при очищеному вірусі везикулярного стоматиту або аденовірусі людини 2 (дані не наведені). Вестерн-блот-аналіз підтвердив наявність каталази, асоційованої з вірусом HSV-1, але не з аденовірусом, вірусом везикулярного стоматиту (VSV) або капсидами HSV-1 A (рис. 1b).
Були проведені контрольні експерименти, щоб підтвердити, що каталаза була пов'язана з HSV-1, а не з домішками, присутніми у препараті вірусу. Очищений HSV-1 центрифугували в смужку на градієнті щільності сахарози, градієнт фракціонували, а Вестерн-блот-аналіз використовували для тестування окремих градієнтних фракцій на наявність каталази. Результати показали, що каталаза присутня у фракціях, що містять віруси, але не у флангових (рис. 1в). Результати інтерпретуються, щоб вказати, що каталаза асоційована з ВПГ-1, а не із забруднюючими речовинами, такими як бактерії, що містять каталазу, або матеріали клітин-хазяїв у препараті вірусу. Оскільки геном HSV-1 не кодує каталазу (22), асоційований з вірусом фермент повинен бути отриманий з клітини-хазяїна. Ранні дослідження вірусу вакцинії продемонстрували наявність каталази всередині зрілого віріона (8). Окрім цього спостереження, ми не знаємо жодного іншого повідомлення про каталазу як компонент вірусної структури.
Більш точне визначення місця розташування каталази було отримано обробкою очищеного вірусу неіонним миючим засобом Triton X-100 (TX-100). При проведенні свіжого вірусу це лікування спричиняє втрату мембрани вірусу, мембранних глікопротеїнів та майже всіх 20 або більше білків тегументу (всі, крім UL36, UL37 та US3) (13, 21, 27). Однак капсид зберігає свою цілісність, і жоден з основних білків капсиду не втрачається. ДНК вірусу зберігається всередині капсиду. Експерименти включали обробку ВПГ-1 1% ТХ-100 та виділення отриманих капсидів центрифугуванням з градієнтом щільності сахарози. Потім був використаний Вестерн-блот-аналіз для тестування капсидів на наявність каталази. Результати продемонстрували, що глікопротеїни вірусу та білки тегументу були видалені, як очікувалось, і що каталаза також була видалена (див. Рис. 2а, смуги 4 та 5). Цей експеримент інтерпретується, щоб вказати, що каталаза присутня в тегументі HSV-1.
Інформація, така як показана на рис. 2, може бути використана для визначення кількості молекул каталази на віріон HSV-1 (15). Це вимірювання проводили, починаючи з двох однакових аликвот очищеного вірусу. Ці два використовувались для визначення (i) кількості основних молекул капсидного білка (UL19) із забарвленого синім гелем Кумасі та (ii) кількості молекул каталази 60 кДа від каліброваного вестерн-блот. У репрезентативному визначенні цей аналіз дав значення 1: 207,5 для молярного відношення каталази до UL19. Оскільки на одну капсиду HSV-1 припадає 955 молекул UL19, кількість молекул каталази на капсид була визначена 955/207,5 або 4,6. Друге подібне визначення дало значення 7,1 молекули каталази. Оскільки в активній молекулі каталази є чотири субодиниці 60 кДа (11, 20), результати вказують на наявність 1–2 тетрамерів каталази на віріон.