Вплив лікування дапагліфлозином на експресію ниркових транспортерів натрію
Джоост Дж. Hoenderop
Кафедра фізіології Інституту молекулярних наук про життя Радбуда
Медичний центр університету Радбуда
Поштова скринька 9101, NL – 6500 HB Неймеген (Нідерланди)
Статті, пов’язані з "
- Електронна пошта
Анотація
Цукровий діабет 2 типу є основною проблемою здоров’я, яка зачіпає 415 мільйонів людей у всьому світі [1, 2]. Це становить 8,3% дорослого населення, з рівними показниками у жінок та чоловіків [3]. З 2012 по 2015 рік приблизно 1,5–5,0 мільйона смертей щороку спричинені діабетом [4]. Діабет та гіпертонія часто виникають разом [5]. Гіпертонія у цих пацієнтів ще більше збільшує їх і без того підвищений серцево-судинний ризик, проте важко впоратися. Дійсно, приблизно у половини діабетичної групи цілі артеріального тиску не досягаються, незважаючи на використання багатьох препаратів, що знижують артеріальний тиск, включаючи діуретики [6-8].
Нещодавно дапагліфлозин, інгібітор ко-транспортера 2 натрію-глюкози (SGLT2), був представлений як новий клас знижувачів глюкози для лікування діабету 2 типу. Оскільки SGLT2 відповідає за приблизно 90% відфільтрованої реабсорбції глюкози в сегментах 1 і 2 проксимальних канальців (PT) [9-11], його інгібування зменшує реабсорбцію глюкози та нирок (Na +) у нирках, що призводить до виведення глюкози з сечею та зниження рівня глюкози в крові [12]. Отже, дапагліфлозин є ефективним новим препаратом для лікування пацієнтів із цукровим діабетом 2 типу [13-16].
Деякі дослідження також продемонстрували, що інгібітори SGLT2 виявляють вражаючий діуретичний ефект і, як наслідок, зниження артеріального тиску, тоді як інші описують помірний вплив на об'ємний статус [17-20]. Інгібування SGLT2 зменшує реабсорбцію PT Na + і тим самим збільшує дистальне канальцеве навантаження Na +, що інгібує активацію ренін-ангіотензин-альдостеронової системи [21]. Нирки ефективно реабсорбують 99% відфільтрованого Na + спільною дією (i) ПТ, де 60–70% реабсорбується через Na + -водневий антипортер 3 (NHE3), SGLT1 та SGLT2 [22]; (ii) товста висхідна кінцівка (TAL) петлі Генле, яка відповідає за 15–25% реабсорбцію парацелюлярними шляхами та транспортером Na-K-2Cl (NKCC2); (iii) дистальний звивистий канальчик (DCT), який реабсорбує 15–25% через чутливий до тіазидів котранспортер Na-Cl (NCC) [23]; (iv) збірний проток (CD), де ENaC сприяє реабсорбції решти 1–2% [10, 24].
Нещодавнє дослідження показало, що лікування інгібітором SGLT2 збільшує експресію білка-транспортера сечовини-А1, аквапорину-2 та NKCC2 [1]. Однак систематичний аналіз компенсаторних механізмів, що регулюють ниркову реабсорбцію Na + після лікування SGLT2, відсутній. Знання того, який сегмент нефрону компенсує проксимальну втрату Na +, представляє великий фундаментальний та клінічний інтерес, оскільки це забезпечить основну фармакологічну мішень для антигіпертензивного лікування.
Метою цього дослідження було виявлення компенсаторного впливу проксимального втрати Na + інгібітором SGLT2, дапагліфлозином, на ниркові транспортери Na + у діабетичних мишей з високим вмістом жиру.
Матеріали і методи
Були використані наступні первинні антитіла
NCC (Millipore, Billerica, MA, США; # AB3553; імуноблотинг [IB] 1: 2000) та овець проти NKCC2, IB 1: 2000 [25], Na +/фосфатний котранспортер (NaPi-2a; добрий подарунок Dr. Кастер та ін. [26]; IB 1: 2000), NHE3 (Millipore, Billerica, MA, США; # AB3085; IB 1: 500) [27], ATP1b1 (Merck KGaA, Дармштадт, Німеччина; # 05-382; ІБ 1: 500) [28]. Вторинними антитілами були такі: козячий анти-кролик, кон'югований з пероксидазою (Sigma-Aldrich; # A4914; IB 1: 10000); кон'югована з пероксидазою овеча антимиша (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Вест-Гроув, Пенсільванія, США; # 515-035-003; IB 1: 10000).
Буфери
Буфер для лізису: 150 мМ NaCl, 50 мМ трис-HCl (рН 7,5), 1 мМ ЕДТА, 1 мМ ЕГТА, 1 мМ ортованадату натрію, 1% (об./Об.) Тритон Х-100, 10 мМ натрію-гліцерофосфат, 50 мМ фтористого натрію, 0,27 М сахарози, 10 мМ пірофосфату натрію, що містить свіжододану таблетку повного коктейлю інгібітора протеази (Рош, Базель, Швейцарія) та 0,1% (об/об) β-меркаптоетанолу. SDS-PAGE буфер зразка: 5 × 10% (мас./Об.) SDS, 10 мМ β-меркаптоетанол, 50% (об./Об.) Гліцерин, 0,3 М Трис-HCl (рН 7,5), 0,05% (мас./Об.) Бромофенол блакитний. TBS-T (сольовий розчин, забуференний трис, 0,1% [об./Об.] Твін 20): Трис-HCl (200 мМ, рН 7,5), 0,15 М NaCl і 0,2% (об./Об.) Твін-20.
Модель тварини
Дорослих швейцарських мишей-самців (Харлан, Оксон, Великобританія) у віці 16 тижнів утримували в приміщенні з кондиціонером при температурі 22 ± 2 ° C з циклом 12/12 год світло/темно. Миші мали вільний доступ до дієти з високим вмістом жиру (45% жиру AFE; Special Diet Services, Вітам, Великобританія; загальна енергія 26,15 кДж/г). Додаткова худорлява група мала вільний доступ до стандартного чау-гризу (Teklad Global 18% Protein Diet Diet; Харлан, Великобританія; загальна енергія 13,0 кДж/г). Всі тварини мали вільний доступ до питної води та відповідної дієти, і протягом усього експериментального дослідження не спостерігалося ніяких негативних наслідків. Усі експерименти проводились згідно з Принципами лабораторного догляду за тваринами (публікація NIH № 86-23, переглянута 1985 р.) Та Положенням про міністерство внутрішніх справ Великобританії (Закон Великобританії про наукові процедури з тварин 1986 р.).
Експериментальні методи лікування
Миші розпочали дієту з високим вмістом жиру на 20-й день і залишалися на цій дієті протягом усього дослідження. На день -6 стрептозотоцин (50 мг/кг; в/в; Sigma-Aldrich, Дорсет, Великобританія), щойно приготований у крижаному 0,1 М Na + цитратному буфері (HCl/pH 4,5), вводили 3 дози загалом протягом періоду 6 днів для індукування діабету. На 0 день одна група мишей з високим вмістом жиру ( = 8) розпочав щоденне лікування дапагліфлозином (1 мг/кг; перорально; Stratech Scientific Ltd., Суффолк, Великобританія) протягом 18 днів, тоді як контрольна група з високим вмістом жиру ( = 8) отримували сольовий розчин (0,9% мас./Об. NaCl; р.о.) один раз на день протягом того самого періоду часу. Об'єм для перорального введення був 100 мкл. Схематичне зображення експериментальної конструкції показано на рисунку 1.
Рис. 1.
Графік експериментального дослідження. Група 1 (нежирний контроль): худі миші на нормальній дієті протягом 38 днів. Група 2 (контролі з високим вмістом жиру): миші починали дієту з високим вмістом жиру на день –20, а згодом отримували лікування СТЗ на день –6. На 0 день сольовий розчин вводили протягом 18 днів. Група 3 (дапагліфлозин з високим вмістом жиру): миші починали дієту з високим вмістом жиру на -20 день, а згодом отримували STZ на день –6. На 0 день дапагліфлозин вводили протягом 18 днів. Худорляві, худі контрольні миші; HFD, дієтичне лікування з високим вмістом жиру; DAPA, миші, оброблені дапагліфлозином; STZ, миші, оброблені стрептозотоцином.