Вплив розвантаження з наступним перевантаженням на експресію колагену та пов’язаних з ним факторів росту в
Анотація
Механізми механічної регуляції експресії колагену, здається, пов'язані з певними факторами росту, що реагують на стрес, включаючи трансформуючий фактор росту-β1 (TGF-β1) та фактор росту сполучної тканини (CTGF), які виражаються у відповідь на механічні подразники і в свою чергу призводять до до індукції експресії колагену у багатьох типах клітин (16, 25, 32, 44, 50). Також відомо, що інсуліноподібний фактор росту-I (IGF-I) індукує синтез колагену в клітинах сухожиль (1, 37), і останні дані підтверджують роль IGF-I та TGF-β1 як медіаторів індукованої навантаженням експресії мРНК колагену в сухожиллі щурів in vivo (23). Виходячи з цього, можна припустити, що зменшення механічного навантаження може вплинути на експресію цих факторів росту в тканині сухожилля.
У скелетних м’язах численні дослідження підтверджують значний шкідливий вплив розвантаження як на біомеханічний, так і на біохімічний рівні (51). Щодо змін у експресії генів, ці дослідження зосереджувались в основному на експресії факторів, пов’язаних із скорочувальними та метаболічними функціями, але є вказівки на те, що на експресію генів, пов’язаних з матрицею, також впливає знижений рівень механічного навантаження (3, 20, 24, 47). Проте скоординована регуляція експресії генів ECM м’язів та експресії генів тканин сухожиль була вивчена лише у відповідь на тривалу денервацію (6). Таким чином, рання реакція на невикористання не вивчалася в цих тканинах одночасно. Крім того, вплив наступного періоду перезавантаження на експресію факторів росту та генів, пов’язаних з матрицею, ніколи не вивчався у сухожиллі, а також щодо цього м’язові дані обмежені.
У цьому дослідженні ми використовували модель підвіски задньої кінцівки для дослідження ефекту втрати активного навантаження м’язової та сухожильної тканин без супутньої втрати серцево-судинного стресу. Клінічною паралеллю до цього може бути ситуація з травмою, не пов'язана з м'язовою та сухожилковою тканинами, така як розтягнення щиколотки, при якій уникається тяга тяжкості пошкодженої ноги. Підвіска задньої кінцівки супроводжувалась періодом нормальної ваги, що відповідає періоду реабілітації.
На основі попередніх досліджень, які вказують на негативний вплив розвантаження на експресію колагену I і III типу в скелетних м'язах (3, 20, 24, 47), ми припустили, що розвантаження задніх кінцівок призведе до зменшення експресії фібрилярних колагенів у м’язи, а можливо і в сухожиллі, з подальшим збільшенням вираження під час перезавантаження.
У тій же моделі ми вивчали вплив на експресію факторів росту, пов'язаних з регуляцією експресії колагену, включаючи TGF-β1, варіанти сплайсингу IGF-I [IGF-IEa та фактор механоросту (MGF)] та CTGF. Беручи до уваги позитивну кореляцію між механічним навантаженням, експресією фактора росту та експресією колагену, можна припустити, що розвантаження призведе до зменшення цих факторів росту, що реагують на стрес, а також до зниження експресії колагену як у сухожиллі, так і в м’язах. Однак дослідження на кістковій та скелетній м'язовій тканині вказують на те, що може не існувати негативної кореляції між розвантаженням тканин та місцевою експресією анаболічних факторів (2, 7, 18, 19, 24, 41). Таким чином, на основі попередніх висновків, ми не очікували зменшення експресії факторів росту в м'язах у відповідь на підвішування задніх кінцівок, тоді як реакцію сухожилля було важко передбачити. Як і при експресії колагенів, ми очікували, що період перезавантаження призведе до підвищення рівня експресії фактора росту.
Нарешті, ми дослідили експресію міостатину, важливого негативного регулятора росту м’язів. Попередні дослідження показали посилення регуляції цього фактора в м’язах у відповідь на суспензію задніх кінцівок (17), тоді як навантаження на опір знижує експресію міостатину (29). Таким чином, ми очікували початкового збільшення експресії міостатину в м'язах під час підвішування задніх кінцівок з подальшим зниженням регуляції під час перезавантаження. У сухожиллі ми раніше спостерігали відносно низький рівень транскрипту міостатину та відсутність реакції на збільшення навантаження. Однак ефект розвантаження раніше не вивчався в цій тканині, і не можна виключати, що це може впливати на експресію міостатину.
Підвіска задньої кінцівки та підготовка тканин.
Суспензію задньої кінцівки (HS) індукували у самок щурів Sprague-Dawley вагою 265 ± 2,5 г (означає ± SE) за допомогою неінвазивної методики відливання хвоста, як описано раніше (46). Коротко кажучи, поворотна система джгутів у поєднанні з литим хвостом була прикріплена до гачка у верхній частині клітки. Це заважало щурам торкатися землі задніми кінцівками, але дозволяло тваринам рухатися по клітці, використовуючи передні кінцівки. Суспензія продовжувалась протягом 14 днів, після чого виливки були вилучені і послідувало 16 днів перезавантаження (RL). Щури тут у 12: 12-годинному циклі світло-темряви і мали вільний доступ до стандартних чау-чау та води. Дослідження було проведено згідно з "Керівними принципами догляду та використання тварин" Американського фізіологічного товариства ", а протокол затверджено Університетським комітетом з догляду та використання тварин в Ірвіні в Каліфорнії.
Підошвенний м'яз, включаючи ахіллове сухожилля, був видалений двосторонньо після періоду призупинення протягом 7 днів (день 7 HS) або 14 днів (день 14 HS), або через 2 (день 2 RL), 4 (день 4 RL), 8 (день 8 RL), або 16 (день 16 RL) днів перезавантаження ( = 8 у кожній групі). Елементи контролю за віком для день 0 (день 0 кон), день 14 HS (день 14 con), та день 16 перезавантажити (день 16 RL con) були включені ( = 8 для кожної групи). Тканину швидко заморожували і зберігали при -80 ° C до подальшого використання.
Вилучення РНК.
РНК екстрагували з тканини, що походить із середнього живота м’яза підошви та з ахіллового сухожилля, за допомогою TRI-реагенту (MRC), згідно з методом, описаним Хомчинським та Саккі (10). Після виділення водної фази РНК осаджували із застосуванням ізопропанолу. Потім гранулу РНК промивали етанолом і згодом розчиняли у воді без РНКази. Всі зразки зважували перед екстракцією РНК. Концентрації РНК визначали за допомогою спектроскопії при 260 нм. Хороша якість РНК забезпечувалась гель-електрофорезом.
RT ПЛР у режимі реального часу.
Рис. 1.Вихід РНК (мкг/мг) з ахіллового сухожилля (A) та підошва () після підвішування задніх кінцівок (HS) та перезавантаження (RL) (відкриті бруски) порівняно з контрольними щурами (сірі смуги). Самки щурів Спрег-Доулі піддавали HS протягом 7 або 14 днів (D 7 HS або D 14 HS), а потім 2, 4, 8 або 16 днів RL (D 2 RL, D 4 RL, D 8 RL, або D 16 RL). День 0, День 0 контроль. Значення є середніми ± SE. *
Таблиця 1. ПЛР-праймери
COL1A1 та COL3A1, колаген I та колаген III відповідно; TGF-β1, трансформуючий фактор росту -β1; CTGF, фактор росту сполучної тканини; IGF-IEa, інсуліноподібний фактор росту I-Ea; MGF, фактор механоросту; RPLP0, великий рибосомний білок P0.
Кількість зразків у кожній групі.
У кожну групу було включено вісім щурів. Для сухожиль задовільний аналіз мРНК був досягнутий для всіх щурів, за винятком день 14 Група ГС і день 16 RL con group, в якій успішно аналізували сухожилля семи щурів. Аналогічно для м'язів, дані для день 14 Група ГС і день 16 RL con групують на основі шести та семи щурів відповідно, тоді як усі інші групи включають дані восьми щурів.