Вплив складу дієти на жир тіла та стеатоз печінки у тварини (Peromyscus
Ліза Кругнер-Хігбі
1 Дослідницький центр тваринних ресурсів та
Стівен Колдуелл
3 Медичний факультет Університету Вірджинії, Шарлоттсвілл і
Кетрін Койл
5 Офіс проректора, Університет Кентуккі, Лексінгтон, Кентуккі; і
Євген Буш
6 Abbott Global Pharmaceutical Research, Абботт-Парк, штат Іллінойс
Річард Аткінсон
4 Обетех, Річмонд, Вірджинія;
Валері Джорс
2 Вісконсинський національний дослідницький центр приматів, Університет штату Вісконсін-Медісон, Медісон, штат Вісконсин;
Анотація
Матеріали і методи
Тварини.
Експериментальний дизайн. 12% дієта, нежирна дієта; Дієта 26%, дієта з помірним вмістом жиру; 45% дієта, дієта з високим вмістом жиру.
Визначення тригліцеридів у сироватці крові.
Кров отримували шляхом кардіоцентезу від мишей, знеболених пентобарбіталом, поміщали на лід і центрифугували для збору сироватки, яку потім заморожували при -70 ° C до аналізу. Зразки лише для аналізу тригліцеридів отримували від негладких мишей. Для вимірювання тригліцеридів у сироватці використовували комерційний набір для тестування (каталог TR0100-1KT, Sigma Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі).
Вимірювання складу тіла.
Анестезія у каліфорнійських мишей була індукована ізофлурановим газом у закритому контейнері та підтримувана з використанням ізофлуранового газу, доставленого через носовий конус. Мишей поміщали на денситометр (Lunar PIXImus, GE Healthcare, Piscataway, NJ) для сканування (версія програмного забезпечення 1.42.006.010, GE Healthcare). Сканування тривало приблизно 15 хв. Склад тіла був зроблений за допомогою денситометричного сканера, який був затверджений для використання на лабораторних мишах. 25
Кінцеве вимірювання складу тіла.
При розтині кишковий вміст туш миші видаляли, а потім решту тушки заморожували при -20 ° C. Тушки автоклавували при 250 ° C протягом 6 годин у великих критих склянках. Отриманий матеріал гомогенізували за допомогою крупноствольного гомогенізатора (PT 6000, Brinkman Instruments, Westbury, NY). Зразки зважували до та після автоклавування. Жир екстрагували метанолом: хлороформом, а потім тушки сушили у вакуумній печі при 60 ° С протягом 48 годин. Триразові зразки перетворювали на золу для визначення вмісту мінеральних речовин. 4
Розподіл жиру в організмі у каліфорнійських мишей.
HR та LR мишей годували або 26%, або 12% дієтою протягом 18 тижнів. Під час розтину печінку оцінювали in situ для грубого підтвердження печінкового ліпідозу, включаючи розширення печінки за межі костохондрального з’єднання, блідість та ретикулярний малюнок. Оцінка не проводилася сліпо до стану лікування, але загальні бали були лише одним показником стеатозу печінки, який використовувався в цих дослідженнях. При видаленні печінки видаляли та зважували. Внутрішньочеревні, гонадні, підлопаткові та пахові жирові прокладки видаляли та зважували.
Гістопатологія.
Каліфорнійських мишей евтаназували за допомогою пентобарбіталу (більше 120 мг/кг ІР). Зразки крові відбирали остаточно за допомогою кардіоцентезу, а праву та ліву частки печінки вільно розсікали та фіксували у 10% нейтральному забуференному формаліні для гістопатологічної оцінки. Зрізи, зафіксовані у формаліні, фарбували гематоксиліном та еозином та оцінювали за допомогою детальної системи балів. 22 Серійні зрізи фарбували трихромом Массона для кращої кількісної оцінки відкладення колагену, пов’язаного з фіброзом. Репрезентативні зрізи печінки фарбували олійно-червоним О для візуалізації печінкових ліпідів. Слайди кодували та оцінювали відповідно до стандартних критеріїв 7,22 щодо стеатозу, апоптозу, запалення та фіброзу ветеринарним патологом (KC), який був сліпим до стану лікування.
Циркулююча концентрація лептину.
Зразки крові отримували шляхом ретроорбітальної кровотечі або кардіоцентезу від мишей під глибокою пентобарбітальною анестезією під час розтину. Сироватку відокремлювали від клітинних елементів центрифугуванням. Сироватку видаляли, поміщали у свіжу пробірку і заморожували при -70 ° C до аналізу. Концентрацію лептину в сироватці крові вимірювали за допомогою комерційних наборів (Імунний аналіз мишачого лептину, Crystal Chem, Downers Grove, IL).
Результати початкових експериментів з кількісного та характеристичного обсягу та розподілу жиру у каліфорнійських мишей показали, що фенотип стеатозу печінки, який спостерігався в попередніх експериментах, може стати більш екстремальним і проявлятися швидше, якщо дієта містила більше жиру. Експерименти з використанням 45% дієти були спрямовані на стеатоз печінки, оскільки жир зберігається в печінці мишей. Групи мишей HR та LR (n = 8) годували 45% дієтою протягом 6 тижнів. Мишей евтаназували, а печінку збирали, зважували та фіксували у 10% нейтральному забуференному формаліні. Зрізи, пофарбовані гематоксиліном та еозином, оцінювали на предмет стеатозу та запалення, як описано раніше. 22 додаткові групи з 4 мишей LR, кожну з яких годували або 12%, або 45% дієтою протягом 6 тижнів. Мишей евтаназували, а зразки печінки заморожували при -80 ° C. Печінку екстрагували та аналізували на вміст ліпідів, білків та золи, як описано нижче.
Аналіз складу печінки.
вологі зразки печінки (1 г) аналізували на відносні ліпідні, білкові та зольні склади. Масу сухої печінки визначали шляхом сублімаційного висушування вологих зразків печінки протягом 72 годин. Ліпідні порції сухих зразків печінки відокремлювали від білка та золи. 16 Зібрані ліпідні фракції сушили під вакуумним центрифугуванням і зважували для визначення маси ліпідів сухих зразків печінки. Вагу білкової та зольної фракцій сухих зразків печінки визначали шляхом віднімання ваги ліпідної фракції із загальної ваги сухої печінки. Результати виражали на грам сухої печінки.
Аналіз даних та статистика.
ANOVA, тести Стьюдента та кореляційний аналіз проводили на параметричних даних за допомогою програмного забезпечення Excel (Microsoft, Redmond, WA). Непараметричні тести, включаючи кореляцію порядку рангу Спірмена з коваріацією, критерій Манна – Уітні та критерій Крускала – Уолліса, проводили за допомогою програмного забезпечення SPSS (SPSS Institute, Cary, NC). Співвідношення шансів розраховували за допомогою Epi Info (Центри контролю за захворюваннями, Атланта, штат Джорджія). Значущість виводили на рівні α менше або рівному 0,05. Дані подані як середнє значення ± SE.
Результати
Передсмертний та посмертний аналіз жиру в організмі.
Сканування DEXA на дорослих каліфорнійських мишах показало, що миші, які харчуються помірним (26%) жиром, отримують додатковий жир в організмі з віком. Каліфорнійські миші, проскановані у віці 1 року, мали істотно (P Малюнок 2 A) 3 тижні перед тим, як мишей евтаназували для аналізу кінцевого жиру в організмі. Контрольну групу вікових каліфорнійських мишей (старше 1 року), які годували дієту з низьким вмістом жиру (12%), сканували одночасно. Каліфорнійські миші, які харчувались дієтою 26%, мали суттєво (P Рисунок 2 B). Не було значущих відмінностей між самцями та самками мишей ні в момент часу (віком 1 або 1,5 року), ні відповідно до дієти. Через три тижні після останнього сканування DEXA, як 12%, так і 26% груп дієти були евтаназовані. Оцінка кінцевого жиру в організмі за допомогою метанолу: екстракція хлороформу підтвердила результати сканування DEXA, оскільки миші, які годували 12% -ю дієтою, мали суттєве значення (P Рисунок 3). Подібно до результатів, отриманих за допомогою сканування DEXA, не було значної різниці між самцями та самками мишей щодо післясмертного жиру в організмі. Кореляційний аналіз порівняння результатів аналізу перед- і післясмертного аналізу жиру в організмі показав набагато вищу кореляцію між результатами аналізу жиру в організмі, проведеного методом сканування DEXA, та хімічним аналізом післясмертного жиру в організмі мишей, які отримували 12% дієту (r = 0,76) ніж для мишей, які харчувались 26% дієтою (r = 0,57). Отже, у мишей, що харчувалися дієтою 26%, виявилося, що запаси жиру були погано оцінені за допомогою сканування DEXA і яких не було у мишей, які годувались 12% дієтою.