Взаємодія субодиниці p70 RPA з матрицею ДНК спрямовує p32 на 3′-кінець зароджується ДНК

Інститут біоорганічної хімії Сибірського відділу Російської академії наук, 630090 Новосибірськ, Росія

Institut fuer Molekulare Biotechnologie Jena, D-07708 Єна, Німеччина

Інститут біоорганічної хімії Сибірського відділу Російської академії наук, 630090 Новосибірськ, Росія

Кафедра молекулярної біології, Університет Вандербільта, Нашвілл, TN 37235, США

Інститут Жака Моно (CNRS, Університет Парижа 6, Університет Парижа 7), 75351 Париж Седекс 05, Франція

Інститут біоорганічної хімії Сибірського відділу Російської академії наук, 630090 Новосибірськ, Росія

Відповідний автор. Факс: (7) (38) 3233 3677 Шукати інші статті цього автора

Інститут біоорганічної хімії Сибірського відділу Російської академії наук, 630090 Новосибірськ, Росія

Institut fuer Molekulare Biotechnologie Jena, D-07708 Єна, Німеччина

Інститут біоорганічної хімії Сибірського відділу Російської академії наук, 630090 Новосибірськ, Росія

Кафедра молекулярної біології, Університет Вандербільта, Нашвілл, TN 37235, США

Інститут Жака Моно (CNRS, Університет Парижа 6, Університет Парижа 7), 75351 Париж Седекс 05, Франція

Інститут біоорганічної хімії Сибірського відділу Російської академії наук, 630090 Новосибірськ, Росія

Відповідний автор. Факс: (7) (38) 3233 3677 Шукати інші статті цього автора

Анотація

Білок реплікації людини А - гетеротримерний білок, який бере участь у різних процесах метаболізму ДНК. Щоб зрозуміти внесок окремих субодиниць реплікаційного білка А у зв’язування ДНК, ми виразили їх окремо як розчинні злиті білки, що зв’язують білки мальтози. Використовуючи конструкцію ДНК, яка включала фотореактивну групу на 3′-кінці ланцюга праймерів, ми показуємо, що субодиниця p70 сама по собі ефективно зшита з праймером при фізіологічних концентраціях. На відміну від цього, зшивання субодиниці p32 вимагало вищих концентрацій білка на два порядки. Ні в якому разі субодиниця p14 не була позначена над фоном. p70, здається, є переважною субодиницею для зв'язування одноцепочечної ДНК, і ця взаємодія позиціонує субодиницю p32 на 3'-кінці праймера.

1. Вступ

Хоча здається очевидним, що p70 зв'язується переважно з областю ssDNA та контактами p32, якщо взагалі, кінцем праймера, невідомо, як кожна з окремих субодиниць сама по собі вносить свій вклад у зв'язування ДНК. Тут ми демонструємо, що головним чином субодиниця p70 може самостійно контактувати з ДНК і що контакти p32 доступні лише в комплексі завдяки позиціонуванню субодиницею p70.

2 Матеріали та методи

2.1 Матеріали

Рекомбінантну ДНК-полімеразу ссавців β (pol β) очищали, як описано [4]. РПА було виражено в кишкова паличка і очищений, як зазначено [5, 6]. Маркери молекулярної маси білкового кольору веселки були від Amersham, попередньо забарвлені маркери від New England Biolabs та сходи 10 кДа від Gibco BRL. Полінуклеотидна кіназа Т4 була придбана у New England Biolabs. [γ‐ 32 P] АТФ був від ICN. Синтетичні олігонуклеотиди були отримані від GENSET. Nensorb -20 колони були від Дю Понта. NAB ‐ 4 ‐ dUTP був синтезований згідно з Wlassoff та співавт. [7]. Окремі субодиниці RPA були виражені як злиті білки, що зв’язують мальтозу (MBP), і виділені, як це буде описано в іншому місці.

2.2 Аналізи зсуву смуги

Аналізи зсуву смуги, що містяться у 10 мкл суміші, 20 мМ HEPES-KOH рН 7,8, 5 мМ MgCl2, 1 мМ DTT, 0,1 мМ EDTA, 200 нг (що відповідає 0,083 пмоль) ДНК M13mp18 (Pharmacia) та зазначені кількості RPA або Сублідини RPA MBP злиті білки. Через 30 хв при 37 ° C зразок доповнювали 2 мкл завантажувального буфера (10 мМ HEPES-KOH рН 7,5, 1 мМ EDTA, 25% Ficoll 400, 0,1% бромофенолового синього) та електрофорезували в 1% агарозному гелі в TAE буфер (40 мМ трис-ацетат, 1 мМ ЕДТА). Гель фарбували 0,5 мкг/мл броміду етидію, а ДНК візуалізували на УФ-трансілюмінаторі.

Аналізи зсуву смуги також встановлювали за допомогою 5'-мічених олігонуклеотидів. У цих випадках аналіз містив 2 фмоль (10 000 cpm) зазначеного олігонуклеотиду замість M13mp18 ssDNA. Після інкубації зразки розділяли на 10% поліакриламідних гелях в ТВЕ (89 мМ трис-борат, 89 мМ борна кислота) при 160 В, поки барвник бромофенольного синього не мігрував наполовину в гель. Гель сушили і піддавали дії рентгенівських плівок.

2.3 Радіоактивне мічення олігонуклеотидних праймерів

Дефосфорильовані праймери були 5'-кінцевими фосфорильовані з Т4-полінуклеотид-кіназою, як описано [8]. Непрореаговав [γ‐ 32 P] АТФ видаляли, пропускаючи суміш через колонку Nensorb ‐ 20, використовуючи протокол, запропонований виробником.

2.4 Відпал ґрунтовки-шаблону

Шаблони праймерів відпалювали при молярному співвідношенні 1: 1, спочатку нагріваючи суміш при 90 ° C протягом 1 хв, після чого давали повільно охолонути до кімнатної температури. Послідовності використовуваного праймера та шаблону були такими: 5′ ‐ GGTTCGATATCGTAGTTCTAGTGTATAGCCCCTACC ‐ 3 ′, 3′ ‐ CACATATCGGGGATGG ‐ 5 ′

2.5 Подовження грунтовки у присутності фотореактивних аналогів dNTP

Умови подовження олігонуклеотидів фотореактивними аналогами dNTP були ідентичними умовам, що використовуються для фотосшивання. Синтез ДНК ініціювали додаванням полімерази і проводили протягом 30 хв при 25 ° С. Реакцію припиняли додаванням 10 мкл 90% формаміду, 50 мМ ЕДТА та 0,1% бромофенолового синього. Суміш нагрівали протягом 3 хв при 80 ° С, а продукти аналізували електрофорезом з подальшою авторадиографією.

2.6 Фотохімічне зшивання

RPA та його окремі субодиниці маркували фотореактивним праймером, синтезованим in situ за допомогою NAB ‐ 4 ‐ dUTP в реакції подовження праймера, каталізованого pol β. Реакційні суміші (10 мкл) містили такі стандартні компоненти: 50 мМ Tris-HCl, рН 7,8, 10 мМ MgCl2, 50 мМ KCl, 2 мкМ pol β, 0,8 мкМ шаблон ‐ 5 ′ - [32 P] праймер і 10 мкМ NAB ‐4 ‐ dUTP. Концентрації RPA або окремих субодиниць RPA були такими, як зазначено. Реакційні суміші інкубували при 25 ° С протягом 30 хв, щоб забезпечити подовження праймера. Потім суміші були помічені на парафільмі, який поміщали на лід та ультрафіолетово опромінювали протягом 20 хв монохроматором Baush and Lomb, оснащеним ртутною лампою HBO W надвисокого тиску, що виробляє УФ-світло 315 нм. Реакції зупиняли додаванням буфера Леммлі та нагріванням. Фотохімічно зшиті зразки білка-ДНК відокремлювали електрофорезом додецилсульфат натрію в поліакриламідному гелі (SDS-PAGE) [9] та аналізували за допомогою авторадіографії або за допомогою фосфомагера.

3 Результати

Для того, щоб розкрити ролі окремих субодиниць під час зв'язування ДНК, ми прагнули виразити їх окремо та використати в експериментах зшивання, вилучених з контексту гетеротримерного комплексу. Раніше повідомлялося, що спроби окремо виразити субодиниці RPA у розчинній формі не мали успіху [10]. Для збільшення розчинності субодиниць ми виражали їх як злиті білки MBP (рис. 1А). Ми змогли експресувати всі злиті білки у розчинній формі. Злиті частини цих білків можуть змінювати свої біологічні властивості. Дійсно, злиті субодиниці RPA не можуть асоціюватися в структурі гетеротримерів, але ми припускаємо, що вони зберігають активність зв'язування ДНК. Слід зазначити, що молекулярна маса кожного злитого білка MBP зростає до 48 кДа порівняно з природним.