Заблокований тубуліном стан VDAC вивчали шляхом розділення полімерів та АТФ
Пов’язані дані
Анотація
Нещодавно повідомлене про функціональну взаємодію між залежним від напруги аніонним каналом зовнішньої мітохондріальної мембрани, VDAC та димерним тубуліном спостерігається як оборотна блокада каналу. Використовуючи розподіл полі- (етиленгліколю) з різними молекулярними вагами та вимірювання потенціалу реверсування, ми досліджуємо розмір та іонну селективність повністю відкритих та блокованих тубуліном станів VDAC, відновлених у плоскі ліпідні бішари. У той час як ефективний радіус каналу зменшується лише в 1,34 ± 0,15 рази, селективність змінюється від початково аніонної до катіонної. Безпосередньо вимірюючи розподіл АТФ, ми демонструємо, що ці зміни забороняють АТФ проникати в канал у заблокованому тубуліном стані.
1. Вступ
Нещодавно було виявлено, що один з найпоширеніших білків у цитозолі більшості еукаріотичних клітин, димерний тубулін, є потужним інгібітором залежного від напруги аніонного каналу зовнішньої мітохондріальної мембрани VDAC [1, 2]. Взаємодія тубулін-VDAC розглядається як оборотні переходи каналу, відновленого в плоскі ліпідні мембрани, між його відкритим та блокованим тубуліном станами. Інгібування є високочутливим до напруги, і, залежно від потенціалу зовнішньої мембрани мітохондрій, може знадобитися концентрація тубуліну від мікромолярних до наномолярних. Експерименти з ізольованими мітохондріями свідчать про те, що взаємодія VDAC і тубуліну є функціонально важливим для регуляції дихання мітохондрій [2, 3]. Блокований стан тубуліну все ще є високопровідним іоном (близько 40% провідності відкритого стану в 1 М KCl), що може означати, що інгібування VDAC тубуліном обмежується величиною цієї залишкової провідності. Однак вважається, що головна роль VDAC - регуляція обміну АТФ/АДФ [4-6], а не потік малих іонів, тож справді важливим є ефект блокування тубуліну на транспорт нуклеотидів.
Існує довгий перелік різних сполук, що впливають на регулювання напруги VDAC (див. [4, 5, 7]), де такі поліаніони, як поліаніон Кеніга та декстрансульфат, є найпотужнішими інгібіторами VDAC [8, 9]. Зокрема, було показано, що поліаніон Кеніга інгібує транспорт нуклеотидів аденіну в ізольованих мітохондріях [8] та клітинах [10]. Однак регуляторна дія тубуліну була визнана зовсім недавно [2, 11]. Щоб зрозуміти функціональне значення взаємодії VDAC-тубулін, ми досліджуємо основні біофізичні властивості блокованого тубуліном стану.
У цьому дослідженні ми застосовуємо три підходи для оцінки функціональних особливостей блокованого стану. Спочатку ми оцінюємо зміну характерного радіуса VDAC при його закупорюванні тубуліном за допомогою полімерного розподілу в канал [12, 13] в обох станах. Вичерпний список посилань щодо цього підходу можна знайти в недавній публікації нашої лабораторії [14]. Суть підходу полягає в аналізі проникнення різного розміру полі (етиленгліколю), ПЕГ, в канал, заповнений водою, шляхом вимірювання його провідності у присутності цих полімерів. Провідність каналу по-різному реагує на ПЕГ з різною молекулярною масою, при цьому полімери є досить малими для розподілу в порі, зменшуючи свою провідність залежно від ваги. Виходячи з характерної молекулярної маси полімеру, який відокремлює розділення від виключення, ми робимо висновок, що ефективна площа поперечного перерізу каналу зменшується в два рази в результаті закупорки.
По-друге, ми аналізуємо індуковану блокадою зміну селективності малих іонів в каналі при концентраціях солей, близьких до фізіологічних. Ми показуємо, що селективність каналу змінює свій знак: від переважно аніонної селективності у відкритому стані він переходить до катіонної селективності в блокованому тубуліном.
По-третє, ми оцінюємо розподіл АТФ як у відкритий, так і в заблокований тубуліном канал. Ми виявили, що, перебуваючи у відкритому стані, додавання АТФ зменшує провідність каналу, але це не змінює провідності блокованого тубуліном стану. Ми прийшли до висновку, що АТФ електростатично і, принаймні частково стерично, виключається із заблокованого тубуліном стану VDAC.
2. Матеріали та методи
Процедура відновлення VDAC у ліпідні бішари була описана раніше [2, 15]. Двошарові шари формували з дифітаноїлфосфатидилхоліну (Avanti Polar Lipids, Inc. Alabaster, AL). Якщо не зазначено інше, використовували 1 М водних розчинів KCl, забуференних 5 мМ Hepes при рН 7,4. Потенціал визначається як позитивний, коли він більший на стороні додавання VDAC (цис-сторона). Після введення каналів VDAC тубулін додавали по обидва боки мембрани при постійному перемішуванні протягом 2 хв. Послідовно додавали полі (етиленгліколь) різних молекулярних ваг (Sigma) до кінцевої концентрації 15% (мас./Мас.). Розчин АТФ (Sigma) в 1 М KCl і рН, відрегульований до 7,4, вводили в відсіки камери шляхом перфузії. Струми реєстрували та аналізували, як описано раніше [2] (див. Також Додатковий матеріал).
3. Результати та обговорення
Вплив ПЕГ трьох різних молекулярних ваг на відкриті та блоковані тубуліном стани VDAC показано на малюнку 1. У присутності ПЕГ 106 (рис. 1А) провідність обох станів зменшується додаванням полімеру. Це пов’язано з розподілом полімеру в порі каналу, який витісняє іони та збільшує в’язкість розчину (рис. 1, пунктирними лініями Відкрити та Відкрити (ПЕГ)). Провідність блокованого тубуліном стану також помітно знижується у присутності PEG 106, але значно меншою мірою на PEG 400 (рис. 1A, B, пунктирними лініями Blocked and Blocked (PEG)), що свідчить про те, що це занадто звужуються для молекул ПЕГ 400 до значного розподілу. У випадку ПЕГ 10000 (рис. 1С), відкритий та блокований тубуліном стани демонструють деяке збільшення провідності, що означає, що цей полімер ефективно виключається з обох станів каналу. Також варто відзначити, що ПЕГ посилює взаємодію між тубуліном та VDAC, що призводить до більш частих подій блокування.