Зміни метилювання ДНК, пов’язані з поживною депривацією, загальногеномний аналіз популяції та
Анотація
Передумови
Нещодавно метилювання ДНК було визначено як посередник між внутрішньоутробним впливом голоду та низкою метаболічних та психічних ознак. Однак загальногеномний аналіз є дефіцитним, а поперечний аналіз ускладнюється багатьма потенційними незрозумілими факторами. Більше того, причинно-наслідкові зв’язки важко визначити через відсутність контрольованих експериментальних конструкцій. Тому в поточному дослідженні ми поєднали всебічну оцінку відмінностей метилювання ДНК у геному у людей, які зазнали внутрішнього внутрішньоутробного голоду в Китаї, з дослідженням in vitro, в якому ми позбавили фібробластів харчування.
Методи
Ми порівняли відмінності метилювання ДНК цільної крові між 25 особинами внутрішньоутробно, які зазнали голоду, та 54 здоровими особами контролю, використовуючи платформу HumanMethylation450. In vitro ми проаналізували зміни метилювання ДНК у 10 культурах фібробластів, які були позбавлені поживних речовин протягом 72 годин шляхом утримання фетальної бичачої сироватки.
Результати
Ми виявили три диференціально метильовані області (DMR) у чотирьох генах (ENO2, ZNF226, CCDC51, і TMA7), які були пов’язані з опроміненням голодом в обох аналізах. Аналіз шляхів з даними як зразків голоду в Китаї, так і фібробластів виділив нервову систему та шляхи нейрогенезу як найбільш постраждалі від поживної депривації.
Висновки
Поєднання поперечних та експериментальних даних свідчить про те, що біологічна адаптація до голоду призводить до змін метилювання ДНК у генах, що беруть участь у центральній нервовій системі.
Передумови
Метилювання ДНК - один із епігенетичних механізмів, який відіграє важливу роль у клітинних реакціях на згубний вплив навколишнього середовища, що бере участь у етіології багатьох захворювань [1]. Дослідження показують, що ранній вплив харчової депривації на ранній термін життя пов'язаний зі стабільними відмінностями метилювання ДНК [2, 3]. Позбавлення харчування, особливо внутрішньоутробно та на ранніх стадіях життя, згубно впливає на розвиток людини та суттєво збільшує ризик множинних хронічних захворювань у подальшому житті [3,4,5,6].
Основним прикладом впливу внутрішньоутробного впливу харчової недостатності є когортне дослідження на потомство від матерів, які були вагітними під час голландської голодної зими під час Другої світової війни, яке було інтенсивним та добре задокументованим, але короткотривалим [7]. У цьому дослідженні було виявлено стійке диференційоване метилювання інсуліноподібного фактора росту II (IGF2) як ключового фактора росту та розвитку людини, який бере участь у відповіді на голод внутрішньоутробно [3]. Подальші дослідження цієї когорти виявили зміни метилювання ДНК як медіаторів зв'язку між голодом матері та метаболічними захворюваннями у зрілому віці [6, 8]. Інші епігенетичні відмінності, пов’язані з опроміненням голодом у внутрішньоутробному періоді, пов’язані з шизофренією [9] та діабетом 2 типу [10].
Хоча голландський голод є найбільш широко вивченим голодом у літературі, великий голод у Китаї (1959–1961) був одним із найбільших голодоморів, зафіксованих у всьому світі, і мав більш серйозні наслідки, в результаті яких загинуло 30 мільйонів людей [11]. Нащадки тих матерів, які страждали від голоду, були меншими за тривалістю [5], гіршим станом здоров’я середнього віку [12] та вищим рівнем хронічних захворювань [13, 14]. Дослідження також показали в два рази підвищений ризик розвитку шизофренії серед нащадків, зачатих у розпал голоду [15, 16]. Однак лише одне дослідження метилювання ДНК у всьому геномі повідомляє серед популяції голоду в Китаї [17]. Для подальшого розуміння впливу материнського голоду на зміни метилювання ДНК у нащадків ми порівняли метилювання ДНК у цілому з генома цільної крові китайських учасників, які зазнали голоду в першому триместрі, з неекспонованими контролями з тих самих груп населення.
Оскільки перехресне популяційне дослідження піддається залишковому збентеженню і не дозволяє дослідити прямий ефект харчової депривації, ми згодом провели дослідження in vitro фібробластів людини до та після впливу харчової депривації. Поєднуючи результати загальногеномного підходу метилювання обох досліджень, ми прагнемо забезпечити неупереджене дослідження змін метилювання ДНК, спричинених харчовою депривацією.
Методи
Зразок китайського голоду
Зразок китайського голоду є частиною нашого попереднього дослідження і був детально описаний в інших місцях [9]. Коротше кажучи, добровольців завербували у північній провінції Цзілінь, Китай. Враховуючи майже повне проникнення голоду протягом січня 1960 р. Та вересня 1961 р., Передбачається, що ті, хто народився в цей період, будуть піддані. Всього було включено 79 здорових учасників, з яких 25 були піддані голоду протягом перших 3 місяців у внутрішньоутробному періоді. Усі учасники надали письмову інформовану згоду. У таблиці 1 подано повну інформацію про учасників.
Дослідження фібробластів in vitro
Експеримент in vitro з фібробластами був більш детально описаний раніше [9]. Коротше кажучи, фібробласти були отримані шляхом біоптатів шкіри від п’яти здорових учасників голландського походження, серед яких один чоловік був чоловіком, а чотири жінки (середній вік = 38,4 року, sd = 7,0) (див. Таблицю 1). Усі учасники надали письмову інформовану згоду. Фібробласти висівали в дві колби Т25 в мінімальне ефірне середовище (MEM) (Gibco®) з 15% плодової бичачої сироватки (FBS) (Gibco®) і 1% пеніцилін-стрептоміцину PenStrep (Gibco®) і в атмосфері 95% атмосферної повітря і 5% СО2 при 37 ° C (нормальні умови). Після досягнення 70–80% злиття супернатант видаляли і клітини тричі промивали сольовим розчином, забуференним фосфатом (PBS) (BioWhittaker® Reagents, Lonza). Далі одну з колб Т25 від кожного донора культивували в умовах неголодомору з використанням мінімального ефірного середовища (MEM) (Gibco®) з підтримкою 15% FBS, тоді як інші колби T25 культивували лише в мінімальному основному середовищі (MEM) як стан голоду. Через 72 год клітини збирали з кожної колби і зберігали у вигляді гранул клітин для виділення ДНК.
Обробка ДНК
ДНК із зразків китайського голоду витягували із цільної крові за допомогою набору Gentra Puregene Kit (Qiagen, Валенсія, Каліфорнія, США). Гранули клітин фібробластів використовували для виділення ДНК згідно з інструкціями виробника (Qiagen, Hilden, Німеччина). Концентрацію та якість ДНК досліджували за допомогою NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, штат Массачусетс, США). Біссульфітна конверсія кожного зразка ДНК проводилась відповідно до інструкцій виробника набору Zymo EZ DNA MethylationTM (Zymo, Irvine, CA, USA). Якість та кількість одноланцюжкової ДНК, обробленої бісульфітом, досліджували за допомогою NanoDrop.
Загальногеномний аналіз метилювання ДНК
Контроль якості фібробластів проводився за подібним робочим процесом, як і зразки голодомору в Китаї, але з урахуванням нової метилювальної бічіпчі EPIC. Набір даних був попередньо оброблений у версії R 3.3.1 з пакетом meffil [22] з використанням функціональної нормалізації [23], щоб зменшити небіологічні відмінності між зондами. Щоб врахувати технічні змінні партії, попередню обробку проводили у більшому наборі даних ( = 80), включаючи зразки ДНК інших досліджень, що включали ДНК мозку та крові. Однак нормалізацію проводили лише для зразків фібробластів. Жодної невідповідності між передбачуваним метилюванням статтю та фактичною статтю не було, а також не було зразків із відхиленнями середніх метильованих та неметильованих каналів. Зонди виймали, якщо вони не пройшли контроль якості (виявлення стор значення> 0,01 для> 10% зразків ( = 4610) або кількість бісеру 10% зразків ( = 68)), були неспецифічними [20] або були одним із зондів SNP, включених до масиву для цілей контролю якості. Усі 10 зразків ДНК фібробластів пережили контроль якості, а 862 160 зондів залишили у наборі даних для подальшого аналізу.