Антиоксидантні та залізохелатуючі властивості таксіфоліну та продукту його конденсації з гліоксилом

Шубіна Вікторія Сергіївна

Інститут теоретичної та експериментальної біофізики РАН, Інститутська 3, Пущино, Московська область, Росія 142290

Юрій Васильович Шаталін

Анотація

Вивчали конденсацію таксіфоліну з гліоксиловою кислотою, і властивості отриманого продукту порівнювали з властивостями таксифоліну. Структуру продукту визначали методом ЯМР-спектроскопії. Здатність поліфенолів збивати активні форми кисню (АФК) оцінювали за допомогою люмінол-залежної хемілюмінесценції. Діяльність хелатування заліза та відновлення заліза вивчали за допомогою абсорбційної спектрофотометрії. Було показано, що конденсація призводить до утворення димеру, що складається з двох одиниць таксіфоліну, пов'язаних через карбоксиметиновий місток у положеннях С-6 та С-8 кільця А. Димер виявляв дещо вищу активність поглинання АФК, ніж таксіфолін. Зв’язуюча залізо здатність сполук була пропорційна кількості одиниць поліфенолу. Знижуюча залізо здатність димеру була нижчою, ніж здатність таксифоліну. Таким чином, димер мав вищу антиоксидантну активність, ніж вихідний флавоноїд. Отримані дані можуть бути корисними для кращого розуміння процесів, що відбуваються в продуктах харчування та напоях, та для пошуку нових активних сполук.

Вступ

Матеріали і методи

Хімікати

Моногідрат гліоксилової кислоти, аскорбінова кислота, диметилсульфоксид-d6 (d6-ДМСО), бензол, 3- (2-піридил) -5,6-дифеніл-1,2,4-триазин-4,4′-дисульфонова кислота мононатрієва сіль гідрат (феррозин), 5-аміно-2,3-дигідро-1,4-фталазіндіон (люмінол) та пероксидазу хрону (150 Од/мг) були придбані у Sigma-Aldrich (США). Таксіфолін люб'язно надала Фламена (Росія). Сольовий розчин, забуференний фосфатами, був від компанії Paneco (Росія). Сульфат заліза (II), хлорид заліза (III), перекис водню, соляна кислота, оцтова кислота та ацетат натрію були отримані від компанії Reakhim (Росія). Тетрагідрофуран, ацетон та етанол були придбані у Panreac (Іспанія). Всі хімічні речовини були аналітичного класу. Всі розчини готували з використанням дистильованої води, очищеної системою Milli-Q (Millipore США).

Синтез та характеристика

Коротко, до розчину таксіфоліну (608 мг) у 5 мл тетрагідрофурану додавали 148 мг гліоксилової кислоти та 20 мкл концентрованої соляної кислоти. Суміш кип'ятять із зворотним холодильником протягом 2 год. Хід реакції контролювали за допомогою тонкошарової хроматографії [R f для отриманого продукту та таксифоліну становив 0,242 та 0,387 відповідно; елюенти являли собою суміш бензол – ацетон – етанол 8: 2: 1 (об./об.)]. Розчинник видаляли при зниженому тиску, в результаті чого утворювалася олія. Потім продукт конденсації виділяли у вигляді натрієвої солі, промивали нагрітим етанолом для видалення непрореагували вихідних сполук і сушили під вакуумом.

Структурні особливості отриманого продукту визначали за допомогою ЯМР-спектроскопії (1 H, 13 C, HSQC, HMBC). Спектри 1 H, 13 C, HSQC та HMBC вимірювали на спектрометрі Bruker Avance-III 600 при 600 (для протону) та 150 МГц (для вуглецю). Продукт розчиняли в d6-ДМСО.

Активність вилучення АФК

Взаємодія поліфенолів з іонами заліза

Через низьку розчинність гідроксидів заліза, що утворюються в розчині під час гідролізу солей заліза, дослідження проводили в ацетатному буфері при рН 5,4

Залізохелатуюча активність

Залізознижуюча активність

Активність відновлення заліза поліфенолів оцінювали за допомогою модифікованого методу феррозину (Mira et al. 2002). Комплекс, що утворюється між феррозином та Fe 2+, був виявлений на зчитувачі мікропланшетів Tecan Infinite F200 (Австрія) у 96-лункових планшетах (Greiner) при 562 нм при 37 ° C. Коротко кажучи, готували розчини, що містять феррозин (1 мМ) та поліфеноли або аскорбінову кислоту в різних концентраціях (12, 18, 26, 40, 59, 90 мкМ). Потім до сумішей додавали розчин хлориду заліза (III) (з кінцевою концентрацією 100 мкМ). Абсорбцію реєстрували через 0,5, 1, 2, 3 та 4 год. Концентрацію Fe 2+ оцінювали калібрувальною кривою, отриманою з використанням розчинів FeSO4 (діапазон концентрацій від 0,8 до 120 мкМ).

В якості стандартного антиоксиданту використовували аскорбінову кислоту, яка здатна знешкоджувати АФК та зменшувати іони перехідних металів.

Статистичну обробку даних проводили за допомогою програми MS Excel 2003. Значення представлені як середнє значення ± стандартна похибка середніх значень трьох-шести незалежних експериментів.

Результати

Характеристика отриманого продукту

В результаті конденсації був отриманий світло-жовтий порошок. УФ-спектр продукту, розчиненого в PBS, показав максимуми смуги поглинання при 224, 290 та 332 нм. Ці смуги поглинання характерні для флавоноїдів. Поглинання продукту в концентрації 21,28 мкг/мл при 332 нм було таким же, як і в таксіфоліну в концентрації 9,12 мкг/мл. Коли концентрація продукту була збільшена до 64,5 мкг/мл і вище, в спектрі з'явилася нова смуга поглинання з центром при 512 нм. На противагу цьому, розчини таксіфоліну не всмоктувались у видимій області. Розчинність продукту у водних розчинах була більш ніж у 10 разів вищою, ніж у таксіфоліні. Логарифм коефіцієнта розподілу (logP) для продукту становив 1,13 ± 0,12, тоді як logP для таксіфоліну становив 1,64 ± 0,17.

Таблиця 1

ЯМР (1 H, 13 C, HMBC) характеристики отриманого продукту

ПоложенняδCδHHMBC

2	83,02; 83,28 (СН)	4,85 (2Н, м)	С-2, С-3, С-1 ', С-2', С-6 '
3α	71,87; 71,97 (СН)	4,34 (2Н, м)	C-2, C-3, C-1 ′
4	196,91; 196,09 (C = O)	-	-
HCCOO -	68,49 (СН)	5,11 (1 год, с)	HCCOO -, C-4a, C-7, C-8a, COO -
4а	108,48	-	-
5	161,76; 161,87 (C)	12,11 (с, ОГ)	-
6	97,63; 97,48 (СН)	5,57 (1 год, с)	С-4а, С-6, С-7
7	163,18 (С)	12,80 (с, ОН)	-
8	98,71; 98,51 (СН)	5,63 (1 год, с)	С-4а, С-8
8а	160,11; 160,25 (С)	-	-
1 ′	128,92 (С)	-	-
2 ′	115,58; 115,66 (СН)	6,72 (2Н, м)	С-2, С-1 ', С-2', С-3 '
3 ′	145,39 (С)	9,00 (бр. С, ОН)	-
4 ′	146,10; 146,17 (С)	9,00 (бр. С, ОН)	-
5 ′	115,71; 115,79 (СН)	6,75 (2Н, м)	C-4 ′, C-5 ′, C-6 ′
6 ′	119,52; 119,70 (СН)	6,88 (2Н, м)	C-4 ′
COO -	176,35; 173.40 (COO -)	-	-