Багатосеротипний підхід уточнює білок контрольного катаболіту А Регулон у основної людини

Предмети

Анотація

Білок контролю катаболіту A (CcpA) є висококонсервативним головним регулятором використання джерела вуглецю у грампозитивних бактерій, але регулон CcpA залишається невизначеним. У цьому дослідженні ми мали на меті уточнити регулон CcpA, визначивши вплив CcpA-інактивації на вірулентність та транскриптом трьох різних серотипів основного людського патогену групи A Стрептокок (ГАЗ). Інактивація CcpA суттєво зменшила вірулентність ГАЗ у широкому спектрі моделей тварин, що відповідають вимогам, що відповідає ідеї, що CcpA є критичним для грампозитивного бактеріального патогенезу. Завдяки порівняльній транскриптоміці ми встановили, що регулятор ядра CcpA GAS збагачений висококонсервативними мотивами зв'язування CcpA (тобто. кре сайтів). І навпаки, специфічні для штаму відмінності в транскриптомі CcpA, мабуть, складаються з уражених вторинних мереж. Доопрацювання кре склад сайту шляхом аналізу основного регулону сприяв розробці модифікованого кре консенсус, який свідчить про покращення прогнозування цілей CcpA в інших медично значущих грампозитивних патогенів.

Вступ

Кілька досліджень продемонстрували зв'язок між CcpA та вірулентністю основних грампозитивних патогенів, таких як Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mutans, Золотистий стафілококк, Clostridium difficile, Bacillus anthracis і Enterococcus faecium 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. У світлі величезного тягаря грампозитивних бактеріальних інфекцій, CcpA є одним із найвпливовіших регуляторних білків, що модулюють ландшафт вірулентності патогенних бактерій 26. Незважаючи на те, що вони були широко досліджені протягом 20 років, залишаються численні критичні прогалини у знаннях щодо функції CcpA та її впливу на бактеріальний патогенез. Наприклад, хоча CcpA, як відомо, впливає на експресію

15% геномів численних видів бактерій, вплив прямого та опосередкованого CcpA-опосередкованого впливу на транскрипцію залишається незрозумілим 15,27. Подібним чином роль CcpA у грампозитивній бактеріальній вірулентності в основному вивчалася на моделях бактеріємії, які представляють лише частину видів інфекцій, які спричиняють бактерії, що містять CcpA 28. Потрібна додаткова інформація щодо внеску CcpA у грампозитивний бактеріальний патогенез, враховуючи потенційну роль осі CcpA- (HPr-Ser46-P) -HPrK/P як нової антимікробної мішені 29 .

Більшість знань щодо опосередкованих CcpA ефектів на експресію генів мали місце в авирулентах Bacillus subtilis що віддалено пов'язане з більшістю організмів, у яких роль CcpA у патогенезі встановлена 16,21,30,31. На відміну від групи А Стрептокок (GAS) викликає у людей широкий спектр інфекцій, для яких встановлені тваринні моделі 32, робиться менш вірулентним завдяки інактивації CcpA і тісно пов'язаний з іншими організмами, на інфекційність яких впливає делеція CcpA, такими як S. pneumoniae і Streptococcus suis 15,18. Таким чином, ГАЗ може бути використаний для оцінки природи регуляторного впливу CcpA на інфекційність грампозитивних патогенів. Раніше ми встановили, що інактивація CcpA у штамі GAS серотипу впливає на експресію

15% геному і зменшує летальність на моделі бактеріємічної інфекції. Існує> 140 різних М серотипів ГАЗ, і інактивація регуляторного білка може мати різно різні ефекти залежно від серотипу ГАЗ, що вивчається 33,34. Таким чином, ми прагнули вивчити CcpA-інактивацію в множинних серотипах GAS, щоб перевірити гіпотези про те, що вплив CcpA-інактивації на вірулентність GAS не залежить від серотипу і що порівняльна транскриптоміка штамів GAS, у яких відсутня CcpA, полегшить ідентифікацію основного регулятора CAS GcpA.

Результати і обговорення

CcpA делеція має специфічні для серотипу ефекти

Щоб покращити розуміння внеску CcpA у широку патофізіологію ГАЗ-інфекцій, ми прагнули проаналізувати функцію CcpA у штамів М-серотипу, які є провідними причинами ГАЗ-інфекцій і віддалено пов'язані на основі філогенезу цілого геному (рис. 1а) 36,37,38. Ми також використовували батьківські штами, які повністю послідовно відомі та не мають мутацій у двокомпонентній системі контролю вірулентності (CovRS), яка впливає на транскриптом CcpA, оскільки CovR та CcpA спільно регулюють численні гени GAS 39. Таким чином, ми вибрали штами MGAS2221 (M1), MGAS10870 (M3) та MGAS6180 (M28) для нашого дослідження 36,37,38. Послідовність білка CcpA у цих трьох штамів ідентична (дані не наведені). Інактивація CcpA в цих трьох фонах призвела до значного дефекту росту в багатому середовищі лише для штаму серотипу M3 MGAS10870 (рис. 1b). Хоча чому тільки MGAS10870ΔccpA штам показує дефект росту невідомий, що важливо, цей дефект росту відновлюється в ccpA-доповнений штам (рис. 1b), що пояснюється відсутністю ccpA як основна причина дефекту росту. Відповідно до попередніх спостережень щодо штамів серотипу M1, CcpA-інактивація зменшила розмір колонії у штаму MGAS10870 16,39. І навпаки, колонії MGAS6180 були рівномірно малими і на них не впливала втрата ccpA (Додаткова рис. S1).

Характеристика штамів серотипу GAS M та їх ccpA похідні.

(a) Філогенез цілого геному послідовних штамів GAS. Повні геноми GAS із зазначеними M серотипами (синього кольору) були отримані від NCBI. Взаємозв'язки були виведені з 68 084 основних однонуклеотидних локусів поліморфізму (SNP) за допомогою SplitsTree. Розташування батьківських штамів, використаних у цій роботі, позначено червоним кольором. () Криві зростання для дикого типу, ccpA-інактивовані та доповнені штами в THY. Точки даних - це середнє та стандартне відхилення від повторюваних зразків кожного штаму, виміряні двічі незалежно.

CcpA впливає на вірулентність ГАЗ у багатьох моделях зараження

Ефект від ccpA делеція на вірулентність штамів серотипу GAS на мишачих моделях інфекції.

Швейцарським мишам CD-1 інокулювали штами GAS внутрішньочеревно (a) або інтраназально () маршрут. Мишей спостерігали майже до смертності за моделлю бактеріємії (a) і виживання було зображено. Для ротоглоткової моделі (), мазки з горла отримували щодня, і щільність бактерій проводили графіком. Значення P були отримані в результаті аналізу повторних вимірювань (див. Методи).