Дефіцит фактора росту фібробластів 21 посилює індуковану ожирінням атрофічну реакцію скелета
Анотація
Передумови
Запалення скелетних м'язів, спричинене ожирінням, є головним фактором втрати/атрофії скелетних м'язів і пов'язане з метаболічними ускладненнями, такими як резистентність до інсуліну. Відомо, що фактор росту фібробластів 21 (FGF21) є важливим метаболічним регулятором із протизапальними властивостями. Однак вплив FGF21 на атрофію скелетних м’язів незрозумілий. У цьому дослідженні ми досліджували вплив дефіциту FGF21 на спричинене ожирінням запалення скелетних м’язів та атрофію у мишей.
Результати
Експресія атрофічних факторів (MuRF1 та Atrogin-1) регулювалася на рівні мРНК та/або білка в скелетних м'язах дефіцитних FGF21 мишей із ожирінням порівняно з контрольними мишами із ожирінням дикого типу. Це супроводжувалось підвищенням рівня запальних цитокінів (TNFα та MCP-1) та зменшенням фосфорилювання AMPK. Лікування FGF21 помітно пригнічувало TNFα-опосередковану запальну та атрофічну реакції в культивованих міотрубках, а дії FGF21 притуплялися сполукою С інгібітора AMPK.
Висновок
Ці дані свідчать про те, що дефіцит FGF21 посилює спричинене ожирінням запалення та атрофічні реакції скелетних м’язів ожирілих мишей, а FGF21 може захищати опосередковану запаленням атрофію через шлях AMPK.
Передумови
Ожиріння тісно пов'язане з втратою/атрофією маси скелетних м'язів, що називається саркопенією, що сприяє слабкості/фізичній ваді [1, 2] та метаболічним ускладненням, таким як резистентність до інсуліну та діабет 2 типу [3]. Індуковане ожирінням запалення скелетних м’язів, що характеризується підвищеним рівнем запальних цитокінів, таких як фактор некрозу пухлини α (TNFα) та інтерлейкін-6 (IL-6), сприяє дисбалансу в синтезі та деградації м’язових білків, що призводить до атрофії м’язів [4]. Зокрема, відомо, що система убиквітин-протеасома, основний шлях деградації білка, є критично важливою для втрати м’язів: система розкладає м’язові білки на дрібні пептиди, включаючи F-box м’язової атрофії (MAFbx, званий атрогін-1) та МІЖНИЙ РІНГ палець 1 (MuRF1) через аденозинтрифосфат-залежні ферментативні реакції [5,6,7]. Відомо, що TNFα безпосередньо індукує шлях убіквітин-протеасоми шляхом активації ядерного фактора-каппа B (NF-κB) у скелетних м’язах [8, 9]. Однак молекули, що беруть участь в індукованій ожирінням атрофії скелетних м’язів, залишаються невловимими.
У цьому дослідженні ми демонструємо, що дефіцит FGF21 посилює індуковану ожирінням атрофічну реакцію та запалення скелетних м’язів мишей, які отримували HFD. Крім того, лікування FGF21 захищає індуковані TNFα атрофічні відповіді в м’язових клітинах, і це було скасовано інгібітором АМФ-активованої протеїнкінази (AMPK).
Матеріали і методи
Культура клітин та лікування
Лінія клітин миобластів миші C2C12 (5 × 10 5 клітин/мл) вирощували при 37 ° C у 5% СО2 в DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), що містить 10% FBS (Life Technologies) і 1% пеніциліну -стрептоміцин (Life Technologies). При впадінні 95–100% середовище замінювали середовищем для диференціювання [DMEM плюс 2% кінської сироватки (Life Technologies)], яке змінювали через 2 дні. Щоб вивчити вплив FGF21 на індуковану TNFα атрофію м’язів, диференційовані міотрубки обробляли протягом 24 годин 100 нг/мл TNFα (Pepro Tech), rmFGF21 (Creative Biomart, Shirley, NY, USA) або обох препаратів у комбінації. Для вивчення зв'язку між ефектом FGF21 на індуковану TNFα атрофію м’язів та AMPK, міотрубки C2C12 обробляли rmFGF21, 20 мкМ сполукою C (інгібітор AMPK, Sigma) та/або 0,5 мМ 5-аміноімідазол-4-карбоксамід-рибонуклеотид ( AICAR, активатор AMPK, Sigma).
Експеримент на тваринах
Мишей з дефіцитом FGF21 (FGF21 нокаутом/KO) на фоні C57BL/6 було придбано в лабораторії Джексона (Бар-Харбор, штат Мексика, США) і виведено в конкретному приміщенні, що не містить патогенів, в Ульсанському університеті. Самців мишей з дефіцитом FGF21 та їх дикого типу (WT) у віці 7 тижнів індивідуально утримували у пластикових клітках із 12-годинним темним циклом світло: 12 годин. Щоб вивчити вплив FGF21 на атрофію скелетних м’язів при ожирінні, мишей протягом 12 тижнів годували дієтою з високим вмістом жиру (HFD) (60% калорій у вигляді жиру від сала та соєвої олії; Research Diets, Нью-Брансвік, Нью-Джерсі, США). і отримали вільний доступ до їжі та води. Тварин приносили в жертву задушенням СО2, а їх м’язи розтинали. Усі догляди за тваринами та процедури проводились відповідно до протоколів та керівних принципів, затверджених Комітетом з догляду та використання тварин Ульсану (LNY-16-020).
Активність NF-κB
Активність зв'язування ДНК NF-κB оцінювали за допомогою набору TransF NF-κB p65 (Active Motif, Rixensart, Бельгія). Зразки тканинних гомогенатів або міотрубок, нормалізованих за вмістом білка, інкубували з іммобілізованими олігонуклеотидами, що містять сайт зв'язування консенсусом NF-κB. Активність зв'язування ДНК аналізували за допомогою антитіл, специфічних для субодиниць NF-κB, відповідно до інструкцій виробника (Active Motif).
ПЛР-аналіз у реальному часі
Загальну РНК екстрагували з міотрубок або зразків м’язової тканини за допомогою триреагенту (Life Technologies, Карлсбад, Каліфорнія, США). Два аліквоти загальної РНК у мікрограмах були зворотно транскрибовані в кДНК з використанням зворотної транскриптази M-MLV (Promega, Madison, WI, USA). ПЛР-ампліфікацію в реальному часі кДНК проводили за допомогою набору SYBR premix Ex Taq (TaKaRa Bio Inc., Фостер, Каліфорнія, США) за допомогою кісток Therm Cycler (TaKaRa Bio Inc., Otsu, Siga, Japan). Всі реакції проводили за однаковою схемою: 95 ° C протягом 10 с, 45 циклів при 95 ° C протягом 5 с і 60 ° C протягом 30 с. Результати аналізували за допомогою програмного забезпечення Real Time System TP800 (TaKaRa Bio Inc.), і всі значення нормалізували до рівнів гена ведення домашнього господарства, β-актину. Праймери, використані в аналізі, наведені в таблиці 1.