Дентигеруміцин - бактеріальний медіатор симбіозу гриба-мураха Природа Хімічна біологія
Анотація
Мурахи-вирощувачі грибів вступають у мутуалістичні асоціації як з грибом, який вони вирощують для їжі, так і з актинобактеріями (Псевдонокардія spp.), які виробляють селективні антибіотики для захисту цього грибка від спеціалізованих грибкових паразитів. Ми проаналізували одну таку систему на молекулярному рівні і виявили, що бактерія пов'язана з мурашкою Apterostigma dentigerum виробляє дентигеруміцин, циклічний депсипептид із сильно модифікованими амінокислотами, для вибіркового пригнічення асоційованого паразитичного гриба (Есковопсис sp.).
Ми розпочали з виділення бактерії (Псевдонокардія sp.), сорт гриба та паразитичний гриб (Есковопсис sp.) від мурахи (Apterostigma dentigerum) гніздо, зібране в Гамбоа, Панама в 2001 р. (код колонії CC011120-4, див. Додаткові методи в Інтернеті; рис. 1а). Псевдонокардія штам, виділений з кутикули A. dentigerum сильно пригнічує Есковопсис ізолят, отриманий з тієї самої колонії (рис. 1b), тоді як сорт грибів відносно стійкий до штаму бактерій (Додатковий рис. 1 в Інтернеті). Початковий LC/MS аналіз як етилацетатного екстракту цільної рідкої культури, так і метанольного екстракту агарової пластинчастої культури Псевдонокардія штам виявив присутність одного основного компонента (додаткова фіг. 2 в Інтернеті). Подальше дослідження, що включало широкомасштабне культивування (8 л) та пробне фракціонування через флеш-колонку C18 та ВЕРХ, підтвердило, що ця основна сполука, яку ми назвали дентигеруміцином (1, 2а), відповідає за Есковопсис гальмування.
(a) Аптеростигма гриб, що вирощує мураху (код колонії CC011120-4), що показує працівника Apterostigma dentigerum. () Попарний випробувальний біопроб демонструє в пробірці пригнічення паразитичного грибка Есковопсис (зверху і знизу) від Псевдонокардія (посередині) (агарова пластина діаметром 8,5 см).
(a) Структура дентигуруміцину (1) містить сильно модифіковані амінокислотні одиниці, такі як піперазинові кислоти. () Крива сприйнятливості доза-реакція, що наносить графік log концентрації дентигеруміцину в мкМ проти щільності клітин грибів (одиниця флуоресценції) Есковопсис, демонструючи пригнічення паразитичного гриба дентигеруміцином з коефіцієнтом мікроіндукції 2,8 мкМ. На панелях помилок відображається s.d.
Дентигеруміцин виділяли у вигляді білого порошку, що має молекулярну формулу C40H67N9O13, як визначено за допомогою мас-спектрометрії ESI-TOF з високою роздільною здатністю у поєднанні з спектральними даними ЯМР 1 H та 13 C (Додаткова таблиця 1 та Додаткова фігура 3 в Інтернеті). Спектр ЯМР 1Н демонстрував 1 синглетний протон низхідного поля при 9,50 м.д., 2 амідні дублетні протони і 12 протонів між 4 і 6 м.д. Спектри ЯМР 13 C та gHSQC показали 7 амідних або складних ефірних карбонільних атомів вуглецю, 5 вуглеводнів, що містять кисень, 9 вуглеводнів, що містять азот, та 19 аліфатичних вуглецевих сигналів. Аналіз спектральних даних gHSQC дозволив призначити всі однозв’язкові кореляційні зв'язки вуглецю та протону та виявив дев'ять протонів, приєднаних до гетероатомів.
Інтерпретація спектрів ЯМР gCOSY, TOCSY, gHSQC та gHMBC призначила шість субструктур, похідних амінокислот, і одну субструктуру, отриману з полікетиду. Сюди входять дві одиниці піперазинової кислоти (Pip-1 та Pip-2), γ-гідроксипіперазова кислота (γ-OH-Pip), β-гідроксилейцин (β-OH-Leu), -гідроксиланін (-OH-Ala), аланін та бічний ланцюг, що несе піран, ацил (рис. 2а та додатковий рис. 4а в Інтернеті). Ключові кореляції HMBC забезпечили послідовність амінокислотних одиниць та ацильний бічний ланцюг (додаткова фіг. 4b), яка завершила площинну структуру дентигеруміцину (рис. 2а). Ми визначили стереохімію дентигеруміцину, використовуючи комбінацію спектроскопічного аналізу, реакцій деградації та дериватизації, як зазначено нижче. Відносна конфігурація піранового кільця в ацильному бічному ланцюзі була визначена за допомогою кореляцій ROESY (Додаткова Рис. 5a в Інтернеті). Відносна конфігурація двох послідовних стереогенних центрів у β-OH-Leu була встановлена як 23 * та 24 * автор J-на основі аналізу конфігурації 8 (додаткова рис. 5b). Відносну конфігурацію γ-гідроксипіперазової кислоти визначали як (5 *, 7 *) -γ-OH-Pip за допомогою константи сполучення 1 H- 1 H та спектрального аналізу ROESY 9 (додаткова рис. 5c).