Дієта з високим вмістом жиру викликає гіперчутливість дихальних шляхів у мишей Наукові звіти
Предмети
Анотація
Експеримент був проведений для вивчення впливу дієти з високим вмістом жиру (HFD) на гіперреактивність дихальних шляхів (AHR) у мишей. Двадцять три дорослих самця мишей C57BL/6 J годували HFD або регулярною дієтою чау протягом двох тижнів. Загальний респіраторний опір вимірювали методом примусових коливань на початковому рівні та після впливу аерозолю метахоліном на рівні 1, 3, 10 та 30 мг/мл. Проведено бронхоальвеолярне промивання (БАЛ). Рівні ліпідів та перекисне окислення ліпідів у легеневій тканині вимірювали разом із експресією генів множинних цитокінів. Легені перетравлювались та визначали секрецію IL-1β легеневими макрофагами. Харчування HFD призвело до збільшення маси тіла на 11% порівняно з чау. HFD не впливав на респіраторну резистентність на початковому рівні, але значно посилив реакцію дихальних шляхів на метахолін порівняно з дієтою чау (збільшення на 40,5 ± 17,7% при 30 мг/мл метахоліну, р
Вступ
Астма є одним з найпоширеніших захворювань, і поширеність астми продовжує зростати, що пояснюється епідеміями ожиріння 1,2,3. Астма при ожирінні, схоже, відрізняється від типової алергічної астми, що викликається TH2, демонструючи погану реакцію на інгаляційні кортикостероїди 4. Можливі механізми включають дихання при менших обсягах легенів, зміну структури дихальних шляхів, посилення окисного стресу в дихальних шляхах та посилення системного запалення 5. Посилення регуляції запалення NLRP3 та IL-1β впливає на астму при ожирінні, спричиненому дієтою з високим вмістом жиру (HFD) 6. HFD є протизапальним через прямий вплив вільних жирних кислот 7. Однак вплив дієти з високим вмістом жиру як такої на гіперреактивність дихальних шляхів (AHR) не досліджували. Ми припускаємо, що дієта з високим вмістом жиру викликає запалення, яке може впливати на AHR незалежно від ожиріння.
Методи
Дослідні тварини
Двадцять три дорослих самців мишей C57BL/6 J віком 10 тижнів (лабораторія Джексона, Бар-Харбор, Массачусетс) годували HFD (TD 03584, Teklad WI, 5,4 ккал/г, 35,2% жиру, 58,4% ккал від жиру, n = 10) або дієта чау (3,0 ккал/г, 4,4% жиру, 13% ккал від жиру, n = 13) протягом 14 днів. Детальна інформація про склад HFD наведена в Додатковій таблиці 1. HFD охолоджували при 4-8 ° C перед тим, як його додавали в клітки. Їжу та воду було забезпечено ad libitum. Мишей утримували у стандартному лабораторному середовищі при температурі 22 ° C у 12-годинному циклі світло/темрява (9:00 - 21:00 включено світло/21:00 - 9:00). Для забезпечення відтворюваності вимірювань мишей розділяли на дві партії (партія 1, HFD, n = 5, дієта чау, n = 6; партія 2, HFD, n = 5, дієта чау, n = 7), які були вивчені через шість місяців з використанням різних партій HFD. Дослідження було схвалено Комітетом з використання та догляду за тваринами університету Джонса Хопкінса (протокол № MO15M257) та відповідало вимогам Американського фізіологічного товариства щодо досліджень на тваринах.
Фізіологічні вимірювання та гістологія
На 14 день мишей знеболювали кетаміном/ксилазином ip, трахеостомізували, а загальний респіраторний опір (Rrs) вимірювали методом примусових коливань (Flexivent) на початковому рівні та після аерозольного впливу метахоліну при 1, 3, 10 і 30 мг/мл, як описано 8,9. Кров відбирали з аорти, проводили бронхоальвеолярний лаваж (BAL) за допомогою 2 × 0,8 мл стерильного сольового розчину, забуференного фосфатом (PBS) через трахеальну канюлю. Грудну клітку відкрили, а праву легеню зв’язали, розібрали вільно і негайно заморозили в рідкому азоті і зберігали при -80 ° C. Залишилася ліва легеня була надута формаліном при тиску 26 смH2O протягом 20 хв, пов'язана і поміщена надута у формалін на 2 дні. Обсяги лівої легені вимірювали водою.
Для гістології ліву легеню зневоднювали в етанолі та вбудовували в парафін. Для морфометрії з поперечних блоків вирізали зрізи товщиною 5 мкм і фарбували трихромом Массона.
Аналіз крові, плазми та тканин легенів
Визначали загальний аналіз крові (CBC). Тригліцериди та вільні жирні кислоти (FFA) вимірювали в гомогенатах легенів та плазмі за допомогою наборів від Wako Inc (Richmond, VA). Інсулін у плазмі та лептин вимірювали за допомогою наборів від Alpco Diagnostics (Salem, NH) та Abcam (Cambridge, MA), відповідно. Рівні глюкози в крові вимірювали за допомогою глюкометра (ACCU-CHECK Aviva Plus, Roche, Indianapolis, IN). Загальну РНК екстрагували з легеневої тканини за допомогою реагенту Trizol (Life Technologies, Rockville, MD). кДНК отримували із загальної РНК з використанням набору Advantage RT для ПЛР від Clontech (Пало-Альто, Каліфорнія). ПЛР у режимі реального часу проводили для панелі цитокінів, включаючи інтерлейкіни (IL) 1β, 4, 5, 6, 10, 13, 17, TNF-α, IL-21, IL-23, адипонектин, лептин, білок вилки коробки вилки (FOXP3), матрична металопептидаза (MMP 9), а також платоподібні рецептори (TLR) -2 і 4 з готовими праймерами від Invitrogen (Карлсбад, Каліфорнія) та зонди Taqman від Applied Biosystems (Фостер Сіті, Каліфорнія) з використанням 18 S як ген ведення домашнього господарства (Додаткова таблиця 2).
Виготовлені на замовлення 18 S праймери були прямими 5′-CTCTTTCGAGGCCCTGTAATTGT-3 ′, зворотними, 5′-AACTGCAGCAACTTTAATATACGCTATT-3 ′ та зондом 6FAM-AGTCCACTTTAAATCCTT. Цільовий рівень мРНК нормалізували до 18 с рРНК, використовуючи формулу: Цільова/18 с = 2 Ct (18 с) –Ct (мішень). Активність ядерного фактора κB (NF- κB) отримували з фосфорильованого до загального білка IκBα за допомогою набору від Abcam. Перекисне окислення ліпідів у легенях вимірювали за рівнем малонового диальдегіду за допомогою набору від Abcam.
Секреція цитокінів та проточна цитометрія
Наявність даних
Усі дані, отримані або проаналізовані під час цього дослідження, включені в цю опубліковану статтю.
Статистичний аналіз
Усі значення подаються як середні значення ± SEM. Всі дані в дослідженні перевіряли на нормальність за допомогою тесту на придатність хі-квадрат. Статистичне порівняння ненормально розподілених значень проводили за допомогою U-критерію Манна-Уітні. Статистичну значимість для нормально розподілених значень визначали за допомогою t-критерію студента або двостороннього аналізу дисперсійного тесту (ANOVA) з корекцією Бонферроні, коли це доречно. Значення р
Результати
Базові характеристики експериментальних тварин описані в таблиці 1. Харчування HFD протягом 2 тижнів призвело до вищої маси тіла на 11%, ніж у мишей, що годувались чау, удвічі збільшили розмір епідидимальних та заочеревинних жирових прокладок. Варто відзначити, що пахові жирові прокладки не збільшувались. Харчування HFD індукувало гіперглікемію та підвищення рівня інсуліну та лептину в плазмі, тоді як тригліцериди у плазмі були незмінними (табл. 1). У CBC не було різниці (Додаткова таблиця 3). Дієта не впливала на обсяги лівих легенів, які становили 0,16 мл ± 0,03 на дієті чау та 0,18 ± 0,03 на СНВ.
Тестування легеневої функції не виявило різниці в загальному опорі легенів на вихідному рівні між мишами, яких годували чау та HFD (Rrs 0,69 ± 0,04 см H2O * с/мл та 0,63 ± 0,03 см H2O * с/мл, відповідно). HFD значно посилював реакцію дихальних шляхів на метахолін порівняно з дієтою чау (рис. 1).
Дієта з високим вмістом жиру (HFD) збільшила загальний опір дихальної системи (Rrs) у відповідь на метахолін. Значення Rrs були нормалізовані до базового рівня (без суттєвої різниці між групами на вихідному рівні).
Вплив дієти з високим вмістом жиру (HFD) на популяцію лейкоцитів у легенях миші. CD4, CD8 лімфоцити, інтерстиціальні макрофаги, моноцити та альвеолярні макрофаги були ідентифіковані за допомогою проточної цитометрії за протоколом, описаним Мішаріним та ін. (посилання 10) в (A) загальна лейкоцитарна суспензія легенів і (B) популяція прикріплених клітин, як описано в методах.