Дієтична недостатність фолієвої кислоти та добавки фолієвої кислоти погіршують метаболізм і
Анотація
Вступ
З огляду на генетичну мінливість у людській популяції, різні способи життя, надзвичайно мінливий раціон харчування та неточне самозвітування, встановити однозначні зв’язки між дієтою та схильністю до захворювання є важко. Фолат, вітамін групи В, є важливим фактором для ряду метаболічних шляхів, включаючи метилювання ДНК та біосинтез нуклеотидів.1 Хоча дефіцит фолієвої кислоти є проблемою у більшості країн, що розвиваються, в США обов’язкові добавки фолієвої кислоти до зернових продуктів і Канада з кінця 1990-х майже ліквідувала дефіцит фолієвої їжі в цих країнах і зменшила частоту дефектів нервової трубки.41
Фолат важливий для синтезу пуринів і тимідилату, які необхідні для виробництва мітохондріального та цитозольного аденозинтрифосфату (АТФ), загального нуклеотиду трифосфату (NTP) та дезокси-NTP (dNTP). донорний шлях метилу, є критично важливим для виробництва S-аденозилметионіну (SAM), який є важливим для метилювання ДНК, глутатіону та інших макромолекул. Важливо, що, хоча природними фолатами в продуктах є переважно тетрагідрофолати (ТГФ), фолієва кислота (синтетична окислена форма фолатів) є формою, яка в основному використовується для добавок, завдяки економічному синтезу та хорошій біодоступності.
Високий рівень споживання фолієвої кислоти є звичним явищем у сучасному суспільстві, враховуючи як добавки до зерна, так і загальне споживання додаткових вітамінних добавок, енергетичних напоїв та пластівців для сніданку з додаванням фолієвої кислоти.32 Дійсно, багато каш для сніданку збагачені на 160–175% понад рекомендовані рівні, 54 і часто споживаються значно вище рекомендованих порцій. 6 Хоча рекомендована дієтична норма (RDA) для фолієвої кислоти становить 400 мкг/день, добавки фолієвої кислоти вище рекомендованої межі 1000 мкг/день не є рідкістю для жінок дітородного віку.7 Ще більші добові дози, до 5 мг, можуть бути рекомендовані вагітним жінкам з певними передумовами, такими як ожиріння, діабет, статус MTHFR або історія вагітностей, пов'язаних з дефектами нервової трубки.98 Враховуючи те, що доповнена фолієва кислота в основному у формі фолієвої кислоти, яка зазвичай відсутня in vivo, і як було показано, що фолієва кислота пригнічує принаймні один ключовий метаболічний фермент10, важливо, щоб ми отримали повну Нерозуміння того, як ці добавки впливають на клітинний метаболізм.
Враховуючи, що як низький, так і високий вміст фолієвої кислоти пов’язаний з різними захворюваннями, у дослідженні ми намагалися визначити, як модулюючі рівні фолієвої кислоти впливають на обмінні процеси, процеси розвитку та фізіологічні процеси в клітинах-попередниках кровотворення. Вражаюче, ми виявили, що як недостатній, так і надмірний вміст фолієвої їжі в аналогічній мірі порушує обмін нуклеотидів, що призводить до функціональних дефектів у клітинах кровотворення.
Метдос
Добавки мишей та фолієвої кислоти
Мишей годували дефіцитно (FD; 0,1 мг/кг фолієвої кислоти), контролем (CD; 2 мг/кг фолієвої кислоти) або надфолатними дієтами (SD; 10 мг/кг фолієвої кислоти). 2 мг/кг фолієвої кислоти відповідає рекомендаціям Американського інституту харчування для гризунів.21 Чау був придбаний у Research Diets (AIN-76A, за винятком того, що рівень фолієвої кислоти був різним) і стерилізований опроміненням. Вся чау була доповнена антибіотиком сукцинілсульфатіазолом для запобігання виробленню фолатів з кишкових бактерій.
Аналіз мас-спектрометрії для метаболоміки органів
Попередники В-клітин кісткового мозку (ВМ) були виділені методом магнітно-активованої сортування клітин анти-B220 (Miltenyi Biotec) та оброблені для аналізу надшвидкої рідинної хроматографії - мас-спектрометрії (UHPLC-MS), як описано в Інтернет-додаткових методах.
Нецільовий кількісний аналіз метаболоміки 1H-ядерного магнітного резонансу
Виділено ізольованих предків В-клітин від об'єднаних тварин та проведено аналізи ядерно-магнітного резонансу (ЯМР) на спектрометрі Bruker 500 МГц, як описано в Інтернет-додаткових методах.
Пересадка кісткового мозку
Для конкурентних аналізів трансплантації BM, показаних на малюнку 6, цілі донорні BM від мишей на різних рівнях харчової фолієвої кислоти (зелений флуоресцентний білок (GFP) -) змішували у співвідношенні 3: 1 з BM-конкурентами (GFP +) від мишей, що експресували GFP. звичайна фолієва дієта. Для конкурентних аналізів трансплантації BM, показаних на малюнку 6, цілі донорські BM від мишей на різних рівнях харчової фолієвої кислоти змішували у співвідношенні 3: 1 із зеленим флуоресцентним білком (GFP), що експресував BM-конкурента від мишей, які отримували нормальну фолієву дієту.
Проточний цитометричний аналіз та загальний аналіз крові
Одноклітинні суспензії висівали в 96-лункові пластини з круглим дном і промивали буфером для сортування клітин (FACS), що активується флуоресценцією [3% фетальна бичача сироватка (FBS) + 1X сольовий розчин, забуференний фосфатом (PBS) + 2 мМ етилендіамінтетраоцтової кислоти (EDTA); v/v)]. Після промивання клітини фарбували поверхню протягом 1 години на льоду в 50 мкл розчину антитіла та аналізували за допомогою проточної цитометрії для виявлення гемопоетичних популяцій, що представляли інтерес. Використані антитіла перераховані в Додаткових онлайн-методах.
Повний аналіз крові
Периферичну кров відбирали з бічної хвостової вени в гепаринізованих пробірках для мікрофуг у зазначені моменти часу. Повний аналіз крові проводили на Cell-Dyn 1700 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, США).
Статистика
Неспарені t-тести, пропорційні небезпеки Кокса та одностороння ANOVA використовувались для аналізу експериментів, значення яких позначено * P
Рисунок 1. Миші з низьким та високим вмістом фолієвої кислоти мають знижену кількість периферичних лейкоцитів. (A) Мишей BALB/c годували контрольними (CD), фолієво-дефіцитними (FD) та надфолатними (SD) дієтами протягом 4 місяців, а сироватку збирали та аналізували на наявність фолієвої кислоти за допомогою мікробіологічного набору для фолієвої кислоти . Значення представляють середнє значення ± SEM (6 загальних зразків). (B) Показані ваги мишей BALB/c, що зберігаються на CD, FD та SD протягом шести місяців. Ваги представляють середнє значення ± SEM 2 незалежних наборів мишей (6 загальних зразків). (C і D) Повний аналіз крові проводили на периферичній крові, відібраній у мишей BALB/c, які утримувались на дієтах фолієвої кислоти CD, FD та SD протягом 2, 4 та 6 місяців. Значення представляють середнє значення ± SEM від 5–10 мишей/дієти в різні моменти часу. Всі статистичні аналізи проводились із використанням t-критерію Стьюдента щодо CD для кожного експерименту. T-тест Стьюдента був використаний в (A) і (B), порівнюючи як дієти FD, так і SD з CD. У (C) та (D) статистичний аналіз проводили за допомогою одностороннього тесту ANOVA з подальшим тестом Тукі. * P
Враховуючи важливість фолієвої кислоти у виробництві нуклеотидів та АТФ, проводили повний підрахунок клітин крові, щоб визначити, чи впливає зміна рівня дієти фолієвої кислоти на популяції клітин циркулюючої крові. Кількість лейкоцитів постійно зменшувалась у мишей як на дієтах із ЗП, так і на СД, що було очевидно через 4–6 місяців при змінених дієтах (Малюнок 1С). До 6 місяців на цих дієтах також було помітним зменшення кількості периферичних лімфоцитів (рис. 1D). Представлення циркулюючих нейтрофілів та тромбоцитів суттєво не змінилося шляхом модуляції рівня фолієвої кислоти протягом 6 місяців (додатковий малюнок в Інтернеті S1A-S1C); однак гемоглобін і червоні кров'яні клітини в деяких експериментах значно зменшувались при дієтах із ЗП, але не в інших (Додаткова онлайн-таблиця S1D). Важливо зазначити, що мишей, які дотримувались на дієтах FD, SD та CD протягом року, не можна було відрізнити за спостережуваними ознаками, включаючи різницю у вазі (малюнок 1B та додатковий малюнок S1E), активності та виживанні (дані не наведені). У сукупності ці спостереження показують, що миші на дієтах FD та SD підтримували нормальний фізичний фенотип, але виявляли знижений рівень циркуляції лейкоцитів і лімфоцитів.