Диференціально експресовані гени в гангліях Hirudo medicalis після лікування ацетил-L-карнітином

Філія Dipartimento di Ricerca Traslazionale e Delle Nuove Tecnologie в Medicina e Chirurgia, Пізанський університет, Піза, Італія

гени

Філія Dipartimento di Biologia, Пізанський університет, Піза, Італія

Філія Dipartimento di Scienze Agrarie, Genetica Alimentari e Agro-Ambientali, Пізанський університет, Піза, Італія

Філія Dipartimento di Ricerca Traslazionale e Delle Nuove Tecnologie в Medicina e Chirurgia, Пізанський університет, Піза, Італія

Філія Dipartimento di Biologia, Пізанський університет, Піза, Італія

Філія Dipartimento di Scienze Agrarie, Genetica Alimentari e Agro-Ambientali, Пізанський університет, Піза, Італія

Приналежність Dipartimento di Scienze Economico-Estimative e degli Alimenti, Sezione di Chimica Bromatologica, Biochimica, Fisiologia e Nutrizione, Università degli Studi di Perugia, Perugia, Italy

  • Джузеппе Федерігі,
  • Моніка Маккі,
  • Родольфо Бернарді,
  • Россана Скурі,
  • Марчелло Брунеллі,
  • Мауро Дюранте,
  • Джованна Трейна

Цифри

Анотація

Цитування: Federighi G, Macchi M, Bernardi R, Scuri R, Brunelli M, Durante M, et al. (2013) Диференціально експресовані гени в гангліях Hirudo medicalis після лікування ацетил-L-карнітином. PLoS ONE 8 (1): e53605. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053605

Редактор: Тянсен Лі, Національний інститут очей, Сполучені Штати Америки

Отримано: 20 серпня 2012 р .; Прийнято: 30 листопада 2012 р .; Опубліковано: 4 січня 2013 р

Фінансування: Робота підтримана лабораторіями Sigma-Tau (Помеція, Італія). Фінансисти не мали жодної ролі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису. Це не змінює дотримання авторами всіх політик PLOS ONE щодо обміну даними та матеріалами.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Матеріали і методи

Тварини

Були використані дорослі п’явки H. medicalis (8–10 місяців), придбані у Ricarimpex (Eysines, Франція). Тварин утримували в акваріумі при температурі 15–16 ° C під впливом природного циклу світло/темрява. ALC або фізіологічний розчин подавали дорсально за допомогою двох ін’єкцій (одна в ростральну, а інша - в хвостовій частині тіла п’явки), кожна зі 100 мкл/г тварини, як повідомляється в Ristori et al. [6]. ALC свіжо готували, розчиняли у фізіологічному розчині і, при необхідності, буферизували до 7,4 рН NaOH перед використанням. Сольовий розчин містив: 115 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl2, 10 мМ глюкози, забуференний до 7,4 рН 10 мМ трис-малеату.

Повна ізоляція РНК

Групі п'явок вводили фізіологічні розчини (контрольна група, С), тоді як іншій групі - 2 мМ ALC (Sigma Tau Laboratories, Помеція, Італія) (оброблена група, Т). Через одинадцять днів після лікування було виділено загальну РНК згідно з Macchi et al. [23] і зберігається при -80 ° C до виділення РНК.

Будівництво бібліотеки SSH

Полі (А) + РНК виділяли з пулів загальних РНК контролю та обробляли п’явками, використовуючи Системи ізоляції мРНК PolyATract® (Promega, Madison, Wi, USA) згідно з протоколом, описаним виробником. Субстрактивна супресивна гібридизація (SSH) проводилась згідно з Diatchenko et al. [24] за допомогою набору для віднімання кДНК BD PCR-Select (BD Biosciences) після використання BD SMART ™ PCR Synthesis Kit (BD Biosciences Clontech). Процедура SMART вимагає 0,025–1 мкг полі (А) + мРНК, щоб забезпечити ампліфікацію всієї популяції мРНК, що міститься в кожному зразку (обробленому та контрольному). КДНК з оброблених зразків відповідно використовувались як тестер і рушій для прямого та зворотного віднімання відповідно до BD PCR-Select cDNA Subtraction Kit.

Ампліфіковані послідовності кДНК із прямого та зворотного віднімання безпосередньо вставляли у вектор клонування T/A за допомогою набору клонування TOPO TA (Invitrogen, США) згідно з інструкціями виробника.

Ефективність віднімання оцінювали за допомогою ПЛР-ампліфікації з використанням рибосомного гена 5.8S (віднімання було ефективним, якщо зменшували транскрипт 5.8S); праймери були сконструйовані на гені 5.8S рРНК Xenopus laevis (номер приєднання X02995.1) (Таблиця 1).

Диференціальний скринінг віднімих бібліотек кДНК

Отримані клони культивували в середовищі LB з 10 мг/мл ампіциліну в 96-лункових планшетах при 37 ° С. Фрагменти кДНК ампліфікували за допомогою ПЛР із вкладеними ПЛР-праймерами 1 і 2R, які доповнювали адаптери, щоб перевірити наявність та розмір окремих фрагментів.

Клонування послідовності та аналізу

Диференціально експресовані клони секвенували за допомогою автоматизованого секвенування (MWG Biotech Ebersberg, Німеччина). Гомологічні пошуки всіх послідовностей порівнювали з базою даних GenBank EMBL-EBI за допомогою алгоритму BLAST.

Напівкількісна відносна RT-PCR

Зворотну транскрипцію проводили із загальною РНК (4 мкг), попередньо обробленою ДНКазою I (Roche), виділеною з оброблених ALC та контрольних п’явок за допомогою набору SuperScript ™ II RNase H- Reverse Transcriptase (Invitrogen) та Oligo (dT) 12–18 Грунтовка (Invitrogen) відповідно до інструкцій виробника.

Для кожної ампліфікації ПЛР використовували 1 мкл кДНК першої нитки, а ПЛР проводили з використанням генно-специфічних праймерів та гена 5.8S рРНК Xenopus laevis (приєднання № X02995) або альфа-1 тубуліну Hirudo medicalis (приєднання № U67677). 1) використовувались як домашні гени. Послідовності праймерів наведені в таблиці 1.

Відносні кількості кожного продукту ПЛР легко визначали шляхом прямого сканування за допомогою денситометра забарвленого бромідом етидію 2% агарозного гелевого електрофорезу за допомогою програмного забезпечення Quantity One® (Bio-Rad, США). Для стандартизації загальної РНК та ефективності синтезу кДНК зразків інтенсивність смуг стандартизували із середньою інтенсивністю продукту 5,8S або тубуліну у досліджуваних зразках. Співвідношення між значенням аналізованого рівня продукту генного продукту та рівнем продукту 5,8S або тубуліну кожної проби було розраховано на основі трьох незалежних експериментів, проведених для кожного гена. Статистичний аналіз проводили за допомогою тесту Unpaired T (програмне забезпечення GraphPad Prism 4.00). Усі дані виражаються як середні значення ± SE.