Дискримінація між Streptococcus pneumoniae та Streptococcus mitis на основі їх сортування

Науково-дослідний інститут фізико-хімічної медицини, Москва, Росія

Відповідний автор: Л. Н. Ікряннікова, Науково-дослідний інститут фізико-хімічної медицини Міністерства охорони здоров'я Російської Федерації, вул. Малая Пироговська, 119992, Москва, Росія

Науково-дослідний інститут фізико-хімічної медицини, Москва, Росія

Національне агентство з клінічної фармакології та фармації, Москва, Росія

Науково-дослідний інститут фізико-хімічної медицини, Москва, Росія

Національне агентство з клінічної фармакології та фармації, Москва, Росія

Науково-дослідний інститут дитячих інфекцій, Санкт-Петербург, Росія

Санкт-Петербурзький державний медичний університет, Санкт-Петербург, Росія

Науково-дослідний інститут фізико-хімічної медицини, Москва, Росія

Національне агентство з клінічної фармакології та фармації, Москва, Росія

Науково-дослідний інститут фізико-хімічної медицини, Москва, Росія

Національне агентство з клінічної фармакології та фармації, Москва, Росія

Науково-дослідний інститут дитячих інфекцій, Санкт-Петербург, Росія

Санкт-Петербурзький державний медичний університет, Санкт-Петербург, Росія

Науково-дослідний інститут фізико-хімічної медицини, Москва, Росія

Анотація

Вступ

Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mitis, Streptococcus pseudopneumoniae і Streptococcus oralis є близькоспорідненими видами трептококів групових грибів (VGS), що колонізують ротову порожнину людини; однак їх патогенні властивості суттєво відрізняються. Поки S. pneumoniae є основним людським патогеном, асоційованим із позалікарняною пневмонією, менінгітом та середнім отитом, інші представники цієї групи є коменсалами і можуть викликати інфекції лише тоді, коли вони отримують доступ до кровотоку або в умовах імунітету. Клінічні лабораторії повинні мати можливість точно диференціювати S. pneumoniae з інших VGS, які зазвичай зустрічаються в клінічних зразках для полегшення відповідної антимікробної терапії. Однак звичайні фенотипічні методи, такі як морфологія колоній, розчинність у жовчі та тестування на чутливість до оптохінів, а також комерційні системи (API 20 Strep та Vitek 2; bioMe'rieux, Marcy l'Etoile, Франція), не завжди забезпечують точну ідентифікацію. 4 .

Різні гени використовувались як мішені для дискримінації VGS на основі ПЛР: пневмолізин (курсувати) 5, автолізин (lytA) 6, поверхневий пневмококовий антиген A (psaА) 7, і фрагмент ДНК невідомої функції Spn9802 8. Однак застосування цієї стратегії ускладнюється звітами, які Стрептококовий міт і Streptococcus oralis містять гени, що кодують аутолізин та пневмолізин 9-11. Аналіз послідовності генів 16S рРНК також не можна застосовувати для дискримінації VGS через 99% схожості в нуклеотидному складі генів 16S рРНК у цих бактерій 12, 13. Аналіз послідовності rnpB (РНК-субодиниця ендонуклеази Р), содаA (марганцезалежна супероксиддисмутаза), туф (коефіцієнт подовження Tu), гроESL (білки теплового шоку) та rpoГени B (b ‐ субодиниці бактеріальної РНК-полімерази) є більш перспективними, але даних недостатньо для остаточних висновків.

В даний час найнадійніша ідентифікація VGS може бути досягнута за допомогою аналізу кількісних окулярів (MLSA) 14. Цей підхід заснований на побудові філогенетичного дерева на об'єднаних послідовностях семи фрагментів ведення домашнього господарства та відображенні клональних зв'язків між невідомими штамами, що досліджуються, та штамами, що зберігаються у відкритих базах даних. http://viridans.emlsa.net/ дозволяє віднести штами стрептококів до видів у межах VGS. Правильно S. pneumoniae ідентифікація також може бути здійснена за допомогою бази даних mlst.net, яка була розроблена головним чином для внутрішньовидового типізації пневмококів 15. На жаль, MLSA є відносно дорогим і трудомістким.

Нещодавно пряме бактеріальне профілювання за допомогою матрично-допоміжної лазерно-десорбційної іонізації – часу польоту мас-спектрометрії (MALDI-TOF MS) було запропоновано як інструмент для швидкої ідентифікації різних бактерій. На жаль, використовуючи базу даних Biotyper 3.0 (Bruker Daltonics, Бремен, Німеччина) Стрептокок mitis/oralis можна помилково визначити як S. pneumoniae, через виняткову схожість їх мас-спектрів 16-19 .

У цьому дослідженні було застосовано ряд математичних класифікаційних алгоритмів для сортування мас-спектрів VGS шляхом відбору набору масових піків, що розрізняють фенотипово та генетично охарактеризовані ізоляти різних видів VGS. З цих класів було сформовано ряд класифікаційних моделей, які порівняно за параметрами чутливості та специфічності. Нарешті, вдалі моделі пройшли сліпе тестування на випадково обраних S. pneumoniae і S. mitis штами.

Методи

Штами

Загалом у дослідження було включено 62 VGS. Тридцять чотири з них були визначені в нашому попередньому дослідженні як S. mitis і три як S. oralis 20. Двадцять п’ять ізолятів були ідентифіковані як S. pneumoniae на основі розчинності жовчі, сприйнятливості до оптохінів та позитивних результатів тесту «Slidex ® pneumo-kit» (bioMerieux ®, Marcy-l'Etoile, Франція). Для S. pneumoniae ізоляти, серотипи визначали з використанням антисироватки, отриманої від Інституту сироватки крові (Staten Serum Institute) (Копенгаген, Данія) відповідно до рекомендацій виробника. Всі ізоляти VGS зберігали при -80 ° C у флаконах CRYOBANK ™ (Копан, Італія).

До аналізу мас-спектрометрії та генетичних досліджень ізоляти пересівали на агарі Колумбія (Oxoid Ltd, Бейсінгсток, Великобританія) з додаванням 5% овечої крові (інкубація протягом ночі при температурі 35 ° C на повітрі з 5% CO2) та фенотиповими тестами (розчинність у жовчі, сприйнятливість до оптохіну та тест `` Slidex ® pneumo-kit '') повторювались. Тест на чутливість до оптохінів проводили із застосуванням стандартних діагностичних оптохінових дисків (Науково-дослідний центр фармакотерапії, Санкт-Петербург, Росія), на повітрі з 5% СО2.

Аналіз генів: схеми MLST та MLSA

Для генетичних маніпуляцій ДНК стрептококів витягували за допомогою набору «ДНК-експрес» (ТОВ «Lytech», Москва, Росія), відповідно до інструкцій виробника. MLST та MLSA виконувались, як описано Enright та Spratt 15 та Bishop та ін. 14 відповідно. Результати аналізували за допомогою баз даних MLST (http://www.mlst.net) та MLSA (http://viridans.emlsa.net/).