Едаравон пропонує нейропротекцію в моделі діабетичного інсульту шляхом інгібування ендоплазматичного ретикулума

Лабораторія молекулярної нейрофармакології, Департамент фармакології та токсикології, Національний інститут фармацевтичної освіти та досліджень (NIPER), Пенджаб, Індія

Анотація

Хоча нейропротекторний потенціал ЕДР був досліджений раніше, наскільки нам відомо, немає звіту, який описував би нейропротекторний ефект ЕДР у моделі щурів з фокальної мозкової травми в/в, пов'язаної з коморбідним діабетом 2 типу. У цьому дослідженні ми перевірили, чи ЕДР також буде ефективним проти діабетичного інсульту шляхом придушення посиленого стресу ЕР/апоптотичної загибелі клітин. Це дослідження також має значення з огляду на оновлену рекомендацію круглого столу академічної галузі терапії інсульту (STAIR, 2009), яка підтверджує, що експерименти також повинні проводитися на моделях тварин із супутніми захворюваннями для більшої клінічної значущості та кращого перекладу ефективності досліджуваних сполук із доклінічних моделей до клінічних випробувань [19].

Матеріали і методи

Тварини. Самців щурів Sprague ‐ Dawley (120–140 г) було заготовлено з центрального приміщення для тварин інституту. Щурів годували регулярними гранульованими кормами (Ashirwad Industries, Чандігарх) та питною водою ad libitum. Експерименти були належним чином дозволені інституційним комітетом з етики тварин (IAEC), NIPER і проводились відповідно до керівних принципів комітету з метою контролю та нагляду за експериментами на тваринах (CPCSEA), уряд Індії.

Індукція діабету 2 типу у щурів. Індукція цукрового діабету 2 типу проводилася у щурів за допомогою поєднання високожирної дієти (HFD) та низьких доз стрептозотоцину (STZ; Sigma, Сент-Луїс, Міссурі, США), як описано раніше [20]. Коротко кажучи, щурів годували HFD протягом 2 тижнів, а потім ставили діабетиком за допомогою одноразової низької дози STZ (35 мг/кг, в/в) лікування. Зразки крові відбирали спочатку та наприкінці 4 тижнів. Різні біохімічні параметри, такі як глюкоза в плазмі крові, тригліцериди та загальний рівень холестерину, вимірювали за допомогою комерційно доступних колориметричних наборів (Accurex India Pvt Ltd, Мумбаї, Індія). Інсулін у плазмі крові визначали за допомогою набору ELISA (Linco Research, Сент-Чарльз, Міссурі, США). Лише ті щури з рівнем глюкози в плазмі> 300 мг/дл наприкінці 4 тижня вважалися діабетиками та були включені в дослідження.

Приготування та лікування лікарських засобів. EDR (Tocris Bioscience, Ellisville, MO, USA) (1, 3 і 10 мг/кг), потужний поглинач вільних радикалів, розчинили в 1 н. Розчині NaOH і нейтралізували 1 н. HCl для регулювання рН до 7,4 у дозі об'єм 2 мл/кг. EDR вводили внутрішньоочеревинно (внутрішньовенно) одразу (протягом 2 хв.) Після MCAO. Дози EDR були обрані на основі літературного звіту [16]. Нейропротекторний потенціал ЕДР оцінювали як з гістологічних, так і з функціональних неврологічних досліджень через 22 години реперфузії, як описано нижче, порівняно з лікуванням носієм.

Оцінка функціональних неврологічних дефіцитів. Неврологічний дефіцит оцінювали через 22 години реперфузії, як повідомлялося раніше [21]. Неврологічні дані оцінювали за п’ятибальною шкалою. Відсутність неврологічного дефіциту = 0, нездатність повністю витягнути праву лапу = 1, кружляння, якщо потягнуто за хвіст = 2, спонтанне кружляння = 3 не ходило спонтанно і мав пригнічений рівень свідомості = 4.

Оцінка інфаркту мозку та обсягу набряку. Щурів вбивали через 22 години після реперфузії для оцінки інфаркту мозку та обсягу набряку. Мозок розрізали на коронарні зрізи товщиною 2 мм і забарвили 2% розчином 2,3,5-трифенілтетразолію хлориду (TTC), а площу інфаркту та обсягу набряку вимірювали за допомогою програмного забезпечення для аналізу зображень (Leica Qwin, Wetzlar, Німеччина) як повідомлялося раніше [23]. Коротко, області інфаркту всіх відділів мозку накопичувались, щоб досягти загальної площі інфаркту, яку множили на товщину відділів мозку, щоб досягти обсягу інфаркту. Корекцію набряку об’єму інфаркту проводили за формулою, корекція об’єму = (об’єм інфаркту × контралатеральний об’єм)/іпсилатеральний об’єм. Розраховували обсяги обох півкуль, з яких отримували об'єм набряку, віднімаючи протилатеральний об'єм від іпсилатерального об'єму.

Оцінка фрагментації ДНК. Аналіз термінальної дезоксинуклеотидилтрансферази, опосередкований dUTP, позначаючи нікель (TUNEL), проводили для виявлення ступеня фрагментації ДНК в парафіновому відділі мозку, як описано раніше [23]. 3 ′ кінець фрагментованої ДНК маркували за допомогою набору для виявлення фрагментації ДНК - TdT-FragEL відповідно до інструкцій виробника (Merck, США). Позитивні клітини TUNEL підраховували з області півтіні мозкових відділів і виражали як відсоток позитивних клітин TUNEL порівняно із загальною кількістю клітин.

Імуногістохімія. Аналіз імуногістохімії (IHC) для на місці експресію різних білків стресу ER, таких як GRP78 та CHOP/GADD153, проводили, як описано раніше, з використанням набору Vecta для фарбування ABC (Vector Labs, Burlingame, CA, USA) [24]. Специфічне маркування було виявлено з використанням діамінобензидину в якості субстрату. Зрізи фарбували гематоксиліном і спостерігали під світловим мікроскопом (Leica) над іпсилатеральною ділянкою півтіні, а зображення отримували за допомогою ПЗС-камери (Leica). Оскільки GRP78 є конститутивним білком, імунореактивність вимірювали на основі імуногістохімічного бального балу. Оцінка IHC проводилася на основі інтенсивності фарбування наступним чином: 1 - слабкий або відсутність кольору; 2 - дуже низьке фарбування; 3 - помірне фарбування; і 4 - дуже інтенсивне фарбування. Однак CHOP/GADD153 - це індуцибельний білок, який кількісно представлений у відсотках темно-коричневих забарвлених CHOP/GADD153 позитивних клітин порівняно із загальною кількістю клітин.

Вестерн-блот. Вестерн-блот проводили, як описано раніше [25]. Для вестерн-блот-аналізу аликвоти, що містять однакову кількість білка, завантажували в кожну лунку і піддавали 10–12% SDS-PAGE. Відокремлені білки переносили на нітроцелюлозну мембрану і блокували 3% бичачим сироватковим альбуміном протягом 2 годин. Потім мембрани досліджували на білок GRP78 або каспазу-12 шляхом інкубації з первинними антитілами, такими як GRP78 (1: 500, Santa Cruz Biotech. Inc., Санта-Крус, США) або каспазою-12 (1: 1000; Cell Signaling, Даверс, штат Массачусетс, США) з подальшою інкубацією з кон’югованим з лужною фосфатазою (AP) вторинним антитілом (1: 5000, Sigma, США) протягом 2 годин при кімнатній температурі. Плямки візуалізували ферментативною реакцією, інкубуючи із сумішшю 5-бром-4-хлор-3-індолілфосфату (BCIP) та нітросинього тетразолію при кімнатній температурі. Рівне завантаження білка було підтверджено вимірюванням β-актину. Денситометричний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення для аналізу NIH ImageJ. Значення нормалізували за допомогою β-актину.