Екстракт етанолу Syzygium aromaticum зменшує ожиріння, спричинене дієтами, у мишей

CHANG HWA JUNG

1 Відділ досліджень метаболізму та функціональності, Корейський інститут досліджень продуктів харчування, Соннам 463-746;

ДЖІЮН АНН

TAE-IL JEON

ТАЕ ВАН КІМ

2 Департамент харчової науки та біотехнологій, Національний університет Андонг, Кьонгбук 760-749, Республіка Корея

TAE YOUL HA

1 Відділ досліджень метаболізму та функціональних можливостей, Корейський інститут харчових досліджень, Соннам 463-746;

Анотація

Вступ

Надмірна вага та ожиріння стали серйозними глобальними проблемами в останні роки, і недавній звіт підрахував, що 1,5 мільярда дорослих людей у всьому світі страждають від надмірної ваги, серед яких понад 200 мільйонів чоловіків та майже 300 мільйонів жінок страждають ожирінням (1). Колись надмірна вага та ожиріння вважалися проблемами, пов’язаними з країнами з високим рівнем доходу, але нині їх захворюваність зростає в країнах з низьким та середнім рівнем доходу, що є тенденцією, яка пов’язана з хронічним алкоголізмом, надмірним споживанням їжі та малорухливим способом життя. Люди з надмірною вагою та ожирінням стикаються з ризиком розвитку численних хронічних захворювань, включаючи хвороби серця, цукровий діабет та деякі типи раку, а також психологічні та соціальні проблеми.

Надмірна вага та ожиріння, а також неінфекційні хвороби, пов'язані з їх розвитком, в основному можна запобігти. Для запобігання та лікування надмірної ваги та ожиріння можна зробити декілька кроків не лише на індивідуальному та суспільному рівнях, а й на молекулярному. На індивідуальному рівні люди можуть обмежити споживання жиру та цукру, збільшити споживання фруктів та овочів та регулярно займатися фізичними навантаженнями. На соціальному рівні уряди та харчова промисловість можуть сприяти здоровому харчуванню. На молекулярному рівні дослідники ідентифікують та/або розробляють засоби, що попереджають або лікують ожиріння. Нещодавно в центрі досліджень була розробка засобів проти ожиріння, отриманих з натуральних продуктів, процес, який має низку безпечних та економічних переваг перед розробкою фармацевтичних препаратів завдяки багаторічному інвестуванню у розробку ліків. Такі дослідження були підкріплені нещодавніми повідомленнями про те, що традиційні рослинні екстракти були визнані ефективними для зменшення маси тіла in vivo (2,3).

Серед цих екстрактів висушені ароматичні квіткові бруньки Syzygium aromaticum (L.) Merr. & Perry (сімейство Myrtaceae), широко відомі як гвоздика, повідомляють, що вони корисні для лікування зубного болю, головного болю та розладів дихання в азіатських країнах (4). Фітохімічні дослідження показують, що евгенол, який входить до класу фенілпропаноїдів хімічних сполук, та його похідні відповідають за унікальний аромат S. aromaticum, і було встановлено, що він має антимікробну, інсектицидну, антиоксидантну, протипухлинну, протизапальну та анестезуючу властивості (5–10). Незважаючи на ці висновки та повідомлення про його корисність у кількох лікарських програмах, S. aromaticum не досліджували щодо його потенціалу як агента проти ожиріння або харчової добавки. Отже, у цьому дослідженні досліджено вплив етанолового екстракту S. aromaticum (SAE) на модель миші, у якої ожиріння було викликане введенням дієти з високим вмістом жиру (HFD).

Матеріали і методи

Матеріали

Анти-PPARγ (sc-7273), SREBP-1 (sc-366) та CD36 (sc-13572) були придбані у компанії Santa Cruz Biotechnology (Санта-Крус, Каліфорнія, США). Антитіла проти FAS (# 3180) та β-актину (# 4967) були придбані у Cell Signaling (Danvers, MA, USA). Інсулін (I5500), ізобутилметилксантин (I7018), дексаметазон (D4902) та Oil Red O (O0625) були придбані у Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі, США). Набори тригліцеридів сироватки та тканин (TG), загального холестерину (TC) та ліпопротеїдів-холестерину високої щільності (HDL-C) були придбані у компанії Wako Chemicals (Осака, Японія). Набір інсулінових ІФА був отриманий від компанії Shibayagi Co. (Gunma, Токіо, Японія). Комплект лептину ELISA був придбаний у R&D Systems (Міннеаполіс, Міннесота, США).

Приготування екстракту

Сушені квіткові бруньки Syzygium aromaticum були придбані у компанії Omni Herb Company (Сеул, Південна Корея) і екстраговані тричі 70% етанолом при кімнатній температурі протягом ночі. Екстракти об'єднували і концентрували за допомогою роторного випарника, сушили ліофілом у вакуумі і розчиняли в диметилсульфоксиді (ДМСО).

Культура клітин та їх диференціація

Клітини 3T3-L1 культивували в модифікованому Дульбекко середовищі Eagle's (DMEM; Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США) з 1% пеніциліну-стрептоміцином та 10% бичачої сироватки теляти при 37 ° C у 5% CO2. Клітини висівали при щільності 4 × 10 5 клітин/лунку в 6-лункову платівку. Через 2 дні після злиття (0-й день) клітини піддавали дії розчину MDI, що містив 0,5 мМ 3-IBMX, 1 мкМ дексаметазону та 1 мкг/мл інсуліну протягом 2 днів у DMEM з 10% фетальної бичачої сироватки ( FBS). Після індукції клітини переходили на розчин, що містить середовище DMEM, доповнене 1% пеніциліном-стрептоміцином, 10% FBS та 167 нм інсуліном протягом 2 днів. Клітини витримували в середовищі після диференціації (DMEM, що містить 1% пеніцилін-стрептоміцину та 10% FBS) і змінювали кожні 2 дні. Для вивчення впливу SAE на диференціацію преадипоцитів в адипоцити клітини обробляли різними концентраціями SAE через 2 дні після злиття (день 0).

Масляно-червоне фарбування O

Для кількісного визначення клітини фіксували 10% нейтральним формаліном протягом 1 години при кімнатній температурі, промивали забуференним фосфатом фізіологічним розчином (PBS) і потім фарбували протягом 1 години 0,5% олійного червоного O у 60% ізопропанолу. Після промивання дистильованою водою фарбовані клітини спостерігали під мікроскопом. Потім забарвлені краплі ліпідів екстрагували ізопропанолом для кількісного визначення шляхом вимірювання його поглинання при 490 нм.

Тваринні моделі

Самці мишей C57BL/6J у віці 4 тижнів були отримані від Orient Bio Inc. (Сеул, Південна Корея) та акліматизовані до лабораторних умов, що складалися з 12: 12-годинного циклу світло-темрява, 24 ° C та 55% вологості протягом 1 тижня. Потім у віці 5 тижнів мишей випадковим чином розподіляли на три групи; група, яка харчувалася дієтою AIN-76A Американського інституту харчування (нормальна група), група, яка годувалась HFD (група HFD), і група, яка годувала HFD з додаванням 0,5% (мас./мас.) SAE (група HFD + SAE) протягом 9 тижнів. Експериментальні дієти готували, доповнюючи основну дієту AIN-76 20% жиру та 0,5% холестерину (мас./Мас.). Вага тіла та середньодобове споживання їжі вимірювали щотижня. Догляд за тваринами та їх використання відповідали нашим інституційним та національним правилам, і всі експериментальні процедури були затверджені Корейським комітетом з досліджень та догляду за тваринами (KFRI-IACUC, № 2010-0011).

Підготовка зразка та процедури

Через дев'ять тижнів після споживання експериментальних дієт мишей піддавали голодуванню протягом 12 годин, а потім жертвували. Зразки крові відбирали з черевної аорти, центрифугували при 1000 × g протягом 15 хв і зберігали при -80 ° C. Вимірювання рівня TG, TC та HDL-C у сироватці проводили за допомогою відповідного набору. Вимірювання концентрацій інсуліну та лептину в сироватці крові проводили відповідно до інструкцій виробника щодо наборів ELISA для інсуліну та лептину для мишей. Епідидимальні, периренальні та печінкові тканини висікали, зважували та зберігали при -80 ° C до використання. Жирові прокладки печінки та епідидиму або фіксували у 4% розчині формаліну та обробляли для гістологічного дослідження, або заморожували у рідкому азоті та зберігали при -80 ° C до екстракції білка та РНК.

Для визначення загального рівня ліпідів, TG і TC у печінці печінку кожної групи гомогенізували у 5 мл NaCl. Після того, як до кожного гомогенату потім додавали 20 мл розчину Фольха (хлороформ: метанол = 2: 1), отриманий розчин інкубували при 4 ° С протягом 12 годин. Зразки центрифугували протягом 10 хв при 1000 × g, перш ніж органічний шар був видалений і висушений за допомогою Speed Vac. Отриману гранулу розчиняли в етиловому спирті, що містить 25% Triton X-100, а потім аналізували на рівні TG, TC та HDL-C за допомогою зазначених комерційних наборів.